Preparazione di orizzontali Fette di topo adulto Retina per elettrofisiologiche Studi
Summary
Abbiamo sviluppato una preparazione fetta orizzontale della retina di mammifero adulto con il piano di sezionamento parallelo alla superficie della retina. campi dendritiche di neuroni della retina nonradially orientate non sono stati troncati, consentendo lo studio di elaborazione dei segnali con tecniche di patch-clamp e di imaging.
Abstract
preparati fetta verticali sono ben stabiliti per studiare i circuiti e la trasmissione del segnale nella retina dei mammiferi adulti. Il piano di sezionamento in queste preparazioni è perpendicolare alla superficie della retina, che lo rende ideale per lo studio dei neuroni orientate radialmente come fotorecettori e cellule bipolari. Tuttavia, le grandi pergole dendritiche di cellule orizzontali, cellule amacrine in tutto il campo, e le cellule gangliari sono per lo più troncati, lasciando marcatamente ridotta attività sinaptica in queste cellule. Mentre le cellule gangliari e le cellule amacrine sfollati possono essere studiati in un preparato tutto montato della retina, cellule orizzontali e le cellule amacrine situate nello strato nucleare interno sono solo scarsamente accessibili per gli elettrodi in tutto il tessuto della retina.
Per ottenere la massima accessibilità e l'integrità sinaptica, abbiamo sviluppato una preparazione fetta orizzontale della retina di topo, e studiato la trasmissione del segnale alla sinapsi tra i fotorecettori e orizzontalecellule. sezionamento orizzontale consente (1) facile e univoca identificazione visiva dei corpi cellulari orizzontali per l'elettrodo il targeting, e (2) la conservazione dei campi dendritiche cellule orizzontale estesa, come un prerequisito per integro e funzionale cono di ingresso sinaptico a dendriti delle cellule orizzontali.
cellule orizzontali da fette orizzontali esposte attività sinaptica tonica nel buio, e hanno risposto a brevi lampi di luce, con una riduzione di attività sinaptica verso l'interno attuale e diminuita. evidenza immunocitochimica indica che quasi tutti i coni nel campo dendritica di una cella orizzontale stabiliscono sinapsi con i dendriti periferici. La preparazione fetta orizzontale è quindi adatto per studiare le proprietà fisiologiche dei neuroni della retina distese orizzontalmente, nonché la trasmissione del segnale sensoriale e l'integrazione attraverso le sinapsi selezionati.
Introduction
informazioni visive è codificata come un modello dinamico spazio-temporale dell'attivazione fotorecettori, e la sinapsi nastro tra fotorecettori e neuroni di secondo ordine determina il trasferimento valle di informazioni visive. La preparazione fetta verticale della retina dei mammiferi è uno strumento molto utile per studiare l'elaborazione del segnale nei percorsi verticali, cioè tra fotorecettori e cellule bipolari, e tra le cellule bipolari e alcuni tipi di cellule amacrine 1, 2, 3, 4.
Tuttavia, sezionamento verticale determina sempre gravi troncamento dei campi dendritiche di molti neuroni della retina, con conseguente notevole perdita di contatti sinaptici. Soprattutto nella retina esterna, cellule orizzontali sono colpiti a causa delle loro campi dendritiche estesi lateralmente diffondersi e sistemi terminali assone 5. In verticalepreparazione fetta, l'ingresso sinaptico di centinaia di terminali cono fotorecettori ai dendriti di una cellula orizzontale è così ridotto a un paio di contatti sparsi. Questo potrebbe essere sufficiente per studiare le proprietà delle singole sinapsi, ma lo fa in nessun modo rappresentano le capacità di elaborazione del segnale alla base l'attivazione sincronizzata delle sinapsi nastro fotorecettori.
Abbiamo quindi sviluppato una preparazione fetta orizzontale, che lascia quasi tutto il fotorecettore cono di ingresso sinaptica di dendriti di cellule orizzontali intatte e funzionali. Il piano di piste sezionamento parallela alla superficie della retina, idealmente taglio attraverso lo strato nucleare interno tra cellule orizzontali e le cellule amacrine. Così, fette orizzontali della retina esterna vengono creati contenenti, sul sito presinaptica, fotorecettori con segmenti interni ed esterni, nonché terminali sinaptici, e cellule orizzontali e cellule bipolari sul sito postsinaptico. Questa preparazione è adatto to indagare ingressi sinaptici coordinati in dendriti delle cellule orizzontali da tutti i fotorecettori cono all'interno del suo campo dendritiche. E quindi potrebbe rivelarsi utile per comprendere meglio il funzionamento della sinapsi nastro fotorecettore, che è cruciale per il trasferimento di informazioni visive dalla matrice di attivazione dei fotorecettori in una risposta post-sinaptica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Contrariamente alle porzioni verticali, la morfologia dendritica dei neuroni orientate radialmente come cellule orizzontali e cellule amacrine è ben conservata. Rispetto ai preparati intere retina, questi tipi di cellule sono facilmente accessibili per microelettrodi e possono essere studiate da entrambe le tecniche elettrofisiologiche e di imaging. Qui, ci siamo concentrati sulla retina esterna; tuttavia, un approccio simile è stato segnalato in particolare per le cellule amacrine della retina interna <sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 and FE464/11-1 to A.F. The authors want to acknowledge the excellent technical assistance of Andrea Nerz.
Materials
| Ames' Medium | Sigma | A1420 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Carbogen | Air Liquide | ||
| Agarose | Sigma | A9045 | |
| 35-mm petri dish (plastic) | Nunc Thermofisher | 150318 | |
| Glass petri dish | Chemoline | 50-1470-40 | |
| Isoflurane | Dispensary university hospital | ||
| Vibratome injector blade | Biosystems | 39053250 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200 | |
| Vibrocheck | Leica Microsystems | ||
| Microwave | |||
| Water bath | |||
| Forceps | |||
| 20-gauge needles | |||
| Spring scissors | |||
| Curved scalpel blades | |||
| Stereo microscope | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Glass Pasteur pipette |
References
- DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse. Neuron. 50, 735-748 (2006).
- Jackman, S. L., et al. Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response. Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).
- Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods. J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).
- Singer, J. H., Lassová, L., Vardi, N., Diamond, J. S. Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse. Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).
- Peichl, L., González-Soriano, J. Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig. Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).
- Ames, A., Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
- Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J. Vis. Exp. (49), (2011).
- Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells. Development of the Retina. , (1998).
- Feigenspan, A., Babai, N. Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).
- Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. Horizontal slice preparation of the retina. J. Vis. Exp. (1), e108 (2006).
- Babai, N., et al. Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses. J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).
- Thoreson, W. B. Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan & Babai). Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).
