Summary

הכנת פרוסות אופקיות של רשתית למבוגרים עכבר עבור אלקטרו מחקרים

Published: January 27, 2017
doi:

Summary

פתחנו תכשיר חתך אופקי של הרשתית היונקת הבוגרת עם המטוס של חתך במקביל לפני שטח הרשתית. שדות דנדריטים של נוירונים ברשתית אוריינטציה nonradially לא היו מקוצץ, המאפשר חקר עיבוד אותות עם טכניקות תיקון- clamp והדמיה.

Abstract

הכנות פרוסות אנכיות מבוססות היטב ללמוד מעגלים והעבירו אותות ברשתית של יונקי הבוגרים. המטוס של חתך בהכנות אלה הוא בניצב לפני שטח הרשתית, מה שהופך אותו אידיאלי לחקר נוירונים רדיאלית אורינטציה כמו קולטני אור ותאים דו קוטביים. עם זאת, סוכות דנדריטים הגדולות של תאים אופקיים, תאי amacrine רחב בתחום, ותאי גנגליון הן בעיקר קטומות, עזב פעילות סינפטית מופחתת במידה ניכרת בתאים אלה. בעוד תאי גנגליון ותאי amacrine העקורים ניתן ללמוד הכנה שלמה הרכובה של הרשתית, תאים אופקיים ותאי amacrine ממוקמים שכבת הגרעין הפנימית הם רק גרוע נגישים עבור אלקטרודות ברקמת רשתית כולה.

כדי להשיג נגישות מקסימלית ויושרה הסינפטי, פתחנו תכשיר חתך אופקי של רשתית העכבר, ולמדו להעברת אות ב הסינפסה בין קולטני אור ואופקיתאים. חתך אופקי מאפשר (1) זיהוי חזותי קל וחד משמעי של גופי תא אופקיים מיקוד אלקטרודה, ו (2) שמירה על שדות דנדריטים תא אופקי המורחבים, כתנאי מוקדם קלט הסינפטי חרוט שלם ופונקציונלי דנדריטים תא אופקיים.

תאים אופקיים מן הפרוסות אופקיות הציגו פעילות סינפטית טוניק בחושך, והם הגיבו לתדרך הבזקי אור עם ירידה של פעילות סינפטית נוכחית והפחיתה פנימה. ראיות Immunocytochemical מציין שכמעט כל קונוסים בתוך השדה הדנדריטים של תא אופקי להקים סינפסות עם דנדריטים ההיקפיים. בהכנת הפרוסה האופקית ולכן מתאימה גם ללמוד את המאפיינים הפיסיולוגיים של נוירונים ברשתית להאריך אותה אופקית כמו גם להעברת אות חושית ואינטגרציה ברחבי סינפסות שנבחרו.

Introduction

מידע חזותי מקודד כדפוס במרחב ובזמן דינמיקה של הפעלת קולטי אור, ואת סינפסה הסרט בין קולטני אור ונוירונים מסדר השני קובעת את העברת הזרם של מידע חזותי. הכנת החיתוך האנכית של הרשתית היונקת היא כלי בעל ערך רב ללמוד עיבוד אותות במסלולים אנכיים, כלומר בין קולטני אור ותאים דו קוטביים, ובין תאים דו קוטביים סוגים מסוימים של תאי amacrine 1, 2, 3, 4.

עם זאת, חתך אנכי תמיד גורם עיצור חמור של שדות דנדריטים של נוירונים ברשתית רבים, שמוביל לאובדן ניכר של קשרים סינפטיים. במיוחד ברשתית החיצונית, תאים אופקיים מושפעים בשל שדות דנדריטים המורחבים רוחבי להפיץ שלהם ומערכות מסוף האקסון 5. בעוד אנכילהכנת פרוסה, הקלט הסינפטי של מאה מסופי photoreceptor חרוט אל דנדריטים של תא אופקי ובכך מצטמצמת כמה קשרים דלילים. זה עשוי להספיק כדי ללמוד את המאפיינים של סינפסות בודדות, אך היא עושה בשום פנים ואופן לא מייצג את יכולות עיבוד אותות שבבסיס ההפעלה המסונכרנת של סינפסות סרט קולטי אור.

לפיכך, אנו פתחנו להכנת פרוסה אופקית, מה שמשאיר כמעט כל קולטי האור החרוטים קלט הסינפטי על דנדריטים תא אופקיים שלמות ומתפקד. המטוס של ריצות חתך מקביל פני השטח של הרשתית, אידיאלי חיתוך דרך שכבת הגרעין הפנימי בין תאים אופקיים ותאי amacrine. לפיכך, פרוסות אופקיות של הרשתית החיצונית נוצרות המכילות, באתר presynaptic, קולטני אור עם פלחים פנימיים וחיצוניים וכן מסוף הסינפטי, ותאים אופקיים תאים דו קוטביים באתר הפוסט-סינפטי. הכנה זו מתאימה היטב to לחקור תשומות הסינפטי מתואמות לתוך דנדריטים תא אופקיים על ידי כל קולטני האור חרוט בתוך השדה הדנדריטים שלו. זה ובכך עשוי להיות שימושי כדי להבין טוב יותר את פעולתו של סינפסה סרט קולטי האור, שהוא חיוני להעברת מידע חזותי מהמטריצה ​​של הפעלת קולטי האור לתוך תגובה postsynaptic.

Protocol

כל הנהלים בוצעו בהתאם להנחיות לניסויים בבעלי חיים שהונפקו על ידי הרפובליקה הפדרלית של גרמניה. הערה: מכיוון רקמת הרשתית תהיה נטולה חמצן במהלך חלקים ממושכים של הליך זה, כל הצעדים צריכים להתבצע מהר ככל האפשר. עכברים צריכים להיות כהי…

Representative Results

ב פרוסות אופקיות של רשתית העכבר, גופי תא אופקיים ניתן היו לזהות בקלות על פי המורפולוגיה הייחודית שלהם עם מספר דנדריטים העיקרי העולה מתוך (איור 1 א) גוף תא מצולעים. גופי התא האופקיים סמוך לפני השטח של הפרוסה היו נגישים באופן שגרתי עבור אלק?…

Discussion

בניגוד פרוסות אנכיות, את המורפולוגיה הדנדריטים של נוירונים אורינטציה רדיאלית כמו תאים אופקיים ותאי amacrine נשמרה היטב. לעומת הכנות רשתית כולה, סוגי התאים אלה נגישים בקלות עבור microelectrodes ויכולים להיחקר על ידי שני טכניקות אלקטרו והדמיה. כאן, התמקדנו הרשתית החיצונית; עם…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 and FE464/11-1 to A.F. The authors want to acknowledge the excellent technical assistance of Andrea Nerz.

Materials

Ames' Medium Sigma A1420
Sodium Bicarbonate Sigma S5761
Hepes Sigma H3375
Carbogen Air Liquide
Agarose Sigma A9045
35-mm petri dish (plastic) Nunc Thermofisher 150318
Glass petri dish Chemoline 50-1470-40
Isoflurane Dispensary university hospital
Vibratome injector blade Biosystems 39053250
Vibratome Leica Microsystems VT1200
Vibrocheck Leica Microsystems
Microwave
Water bath
Forceps
20-gauge needles
Spring scissors
Curved scalpel blades
Stereo microscope
Plastic Pasteur pipette
Glass Pasteur pipette

References

  1. DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse. Neuron. 50, 735-748 (2006).
  2. Jackman, S. L., et al. Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response. Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).
  3. Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods. J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).
  4. Singer, J. H., Lassová, L., Vardi, N., Diamond, J. S. Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse. Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).
  5. Peichl, L., González-Soriano, J. Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig. Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).
  6. Ames, A., Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
  7. Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J. Vis. Exp. (49), (2011).
  8. Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells. Development of the Retina. , (1998).
  9. Feigenspan, A., Babai, N. Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).
  10. Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. Horizontal slice preparation of the retina. J. Vis. Exp. (1), e108 (2006).
  11. Babai, N., et al. Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses. J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).
  12. Thoreson, W. B. Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan & Babai). Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).

Play Video

Cite This Article
Feigenspan, A., Babai, N. Z. Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies. J. Vis. Exp. (119), e55173, doi:10.3791/55173 (2017).

View Video