JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Published: March 05, 2017
doi:
10.3791/55148
, , ,
1Department of Biosciences and Nutrition,Karolinska Institutet, 2School of Technology and Health,KTH Royal Institute of Technology

Summary

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Abstract

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Introduction

araştırmalarda, çok dikkat lipit etkileşimi, çeşitli yer içsel veya dışsal da zar proteinleri, odaklanmıştır. Lipid etkileşen proteinleri ile çalışma ya deterjanlar gibi lipidler, bir yerine seçilmesi 1 amphipols veya küçük proteinler 2, ya da çözünür ve aktif proteini tutan bir membran yerine bulmak içerir. Lipoik membran yerine lipozomlar ve nanodiscs (ND) 3, 4 içerir.

Nanodiscs doğal kanda meydana gelen, yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL), proteinin bir parçası, Apo-1 mühendisliği tarafından geliştirilen yakın yerli membran platformudur. Apo A-1 kısa amfipatik α-helikslerin 243 kalıntı uzun zincirli ve bir lipit içermeyen çözünebilir bir biçime sahiptir. İn vitro lipid varlığında, protein Apo-1 iki kopya kendiliğinden hydr çevrelemek için yeniden zamanbir lipid iki katmanlı yamanın 5 ophobic asil zincir bölümü. ApoA-1 Engineered Bunlar genellikle membran iskele proteinleri (MSP) olarak adlandırılır ve artan sayıda plazmid ya da arıtılmış, proteinler gibi ticari olarak temin edilebilir. 6 uzun veya daha kısa 7 membran iskele proteinler Apo AI 1 sonuç tekrarlar veya α-sarmal silmeler. Bu da bu mümkün 7 8 mil 17 çapı 6 nm civarında diskleri izin vermektedir. Nanodiscs 3, 9 başvurularının farklı türleri vardır. En yaygın olarak kullanılan uygulama, daha önce 3, 9 yorumlanan bütünsel zar proteini 8 stabilizasyonu için bir yakın yerel membran ortamı sağlamaktır. Daha az keşfedilen kullanımı çalışma için nano ölçekli zar yüzeyi temin etmektirperiferal membran proteinleri 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Protokolün Bölüm 1 Aşağıdaki fosfolipidler ve membran iskele protein oluşan nanodiscs yapmak için prosedürü görüntüler.

Numune hazırlama çoğu yöntemleri bir darboğaz olduğunu. Yöntem özgü örnekleri belirli bilgileri eklemek olabilir, ama aynı zamanda sonuçların karşılaştırılması zorlaştırmaktadır. örnekler modelli ve çok sayıda farklı yöntem doğrudan kullanılabilir, bu nedenle, daha basit bir. Nanodiscs kullanımı ile bir avantajı, lipozomlar (örneğin, numuneler, doğrudan bu protokolde olduğu gibi, TEM ve denatüre edici olmayan jel elektroforezi her ikisi için de kullanılabilir) ile karşılaştırıldığında nanodisc küçük boyutudur.

<p class = "jove_content"> veziküller ve lipozomlar, uzun zar etkileşen proteinlerin fonksiyonunun anlaşılması için kullanılmıştır. Yapısal çalışmalar ve görselleştirme için lipozomlar içinde bir transmembran proteini yapısal kararlılığının bir örnek kullanılabilir 18'dir. Ancak, bir lipozom membranı üzerinde yerleştirilmiş monotopic membran proteini herhangi bir yüksek çözünürlüklü 3D yapı bildiğimiz kadarıyla, henüz yayınlanmıştır. Altın nano parçacıklar veya antikorlar TEM 19 kullanılarak lipozomlar veya veziküller bağlayıcı proteinleri görselleştirmek için kullanılabilmektedir. bu problar çok özel olsa da, bunlar membran bağlanma bölgeleri örterek ya da esnek parçalar ile ilgi alanları maskeleyerek-membran birleştirme proteinleri engelleyebilir. Altın etiketli veya antikor-kompleks proteinler muhtemelen jel üzerinde analiz edilebilir, ancak bu deneyde maliyetini arttıracaktır.

lipozomlar mükemmel bir platform olmasına rağmen, bir pop emin olamazulation lipozom başına protein belirli bir oranı, nanodiscs 20 kullanımı ile keşfedilebilir bir özelliği vardır. bir lipozom içinde, kofaktör ve alt tabakalar çözünür iç sıkışıp edilebilir. zar-çözünen maddeler membran taklitlerinin her iki tür için aynı kaderi paylaşacak. iki tabakalı alanı nanodiscs daha küçük olduğu Bununla birlikte, maddenin daha az miktarda nanodisc membranlar doyurulması için gereklidir.

atom yapısı belirlenmesi yoluyla anlama protein işlev araştırmanın pek çok alanında için gerekli olmuştur. Protein yapı tayini için yöntemler röntgen 21 arasında; nükleer manyetik rezonans (NMR) 22, 23; ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) sirojenik sıcaklıkta 24 cryoEM. cryoEM tarafından çözünürlüğü son zamanlarda büyük ölçüde kaynaklanmaktadır doğrudan elektron de kullanımına, geliştirilmiş26, 25 dedektörler. Makromoleküller yakın bir yerli devlet ince, vitreus buz 27 görüntülenmiş. 200 kDa – Bununla birlikte, biyolojik moleküllerin düşük kontrast nedeniyle, bunlar 100 boyut aralığında tespit etmek zor olur. Uygun büyüklükte numuneler için, veri toplama yapılan ve tek parçacık yeniden yöntemi, bir yapı 28 elde etmek üzere uygulanabilir.

Ancak, TEM ile protein yapısının belirlenmesi çok aşamalı bir süreçtir. Genellikle negatif leke TEM 29 phosphotungsten (PT) 30 veya uranyum 31 gibi ağır metallerin tuzları kullanarak örnek monodispersiteye değerlendirilmesi ile başlar. Olumsuz lekeli makromolekülün düşük çözünürlüklü bir modeli İmar genellikle yapılır ve moleküler yapı 29 hakkında önemli bilgiler verebilir. Paralel,cryoEM başlayabilir kullanarak veri toplama. eser oluşum yanlış yorumlanmasından kaçınmak için negatif leke TEM verilerini değerlendirirken dikkatli olunmalıdır. Belirli bir artefakt fosfolipidler PT leke etkisi ve yan 33 bakıldığında jeton yığınları benzeyen, uzun çubukların oluşumu ile sonuçlanan, 32 lipozomlar. Bu tür "rouleau" veya "yığınları" (bundan sonra "yığınları" olarak belirtilir) nanodiscs 35 daha sonra da HDL 34 için erken gözlenen ve bulundu.

membranların istif ve yeniden şekillendirme çeşitli nedenlerle oluşabilir. Örneğin, bir amonyum molibdat leke 36 TEM görüntülemede bakır gibi ko-faktörler tarafından indüklenebilir. lipozomlar membran lipitlerinin bir kısmı böylece bakır iyonlarının eklenmesinden sonra lipozomlar istifleme, EDTA metal kompleks oluşturmayı taklit bir iminodiacetic asit kafa grubu içerdiği <sclass = "xref"> 36 kadar. İstifleme da bağlı olarak ya da lipid çift tabakaları bir protein ile, protein-protein etkileşimi olabilir 37 (kullanılmış leke söz konusu değildir). PT tarafından fosfolipidlerin yığın oluşumu erken gözlendi; Ancak, daha sonra çalışma kaldırma veya bu eser oluşumu 38 kaldırılmasına odaklanmıştır.

Burada, TEM ile membrana bağlanma proteinlerinin çalışma için istifleme NAPT'yi kaynaklı nanodisc yararlanmak için bir yöntem önerilmektedir. Kısacası, nanodiscs üzerinde bağlayıcı protein istifleme gelen nanodiscs önleyecektir. Istifleme nedenleri açık değildir rağmen, birbirlerine (Şekil 1A) sopa diskleri neden fosfolipid ve PT fosforil grubu arasında bir elektrostatik etkileşim olduğunu 39 önerilmiştir. Protokolde arkasındaki hipotezi, bir protein, bir nanodisc bağlandığında, fosfolipid yüzeyinde en availa olmadığıdır bağlı proteini ile sterik engelleme, PT ile etkileşim için ble. Bu yığın oluşumunu (Şekil 1B) önleyecektir. İki sonuçlar çıkarılabilir. İlk olarak, istifleme önlenmesi ilgili protein ile membrana bağlı olduğu anlamına gelir. İkinci olarak, protein ND kompleksi kompleks kaba morfoloji elde etmek için standart tek parçacık işleme yöntemleri 24, 40 ile muamele edilebilir. Ayrıca, sigara denaturasyon jel elektroforezi ya da dinamik ışık saçılımı gibi yöntemlerle analiz gerçekleştirilebilir.

Bu hipotezi göstermek için, bir çok iltihaplı hastalık 41, 42 yer almaktadır membran bağlayıcı protein 5-lipoksigenaz (5LO) kullanılmıştır. Bu 78-kDa 'lık proteinin zar 43 bağlamak için kalsiyum iyonu gerektirir. Bu zar dernek çalışılmış olmasına rağmen yoğun lipozomlar kullanılaraks = "xref"> 44, 45, 46 ve membran fraksiyonları 47, bu TEM analizi ve yapı belirlenmesi için kullanılamaz.

nanodiscs hazırlanması deterjan ise sodyum kolat içinde yeniden süspansiyon haline lipid ile MSP karıştırılmasıyla başlar. 1 saat boyunca buz üzerinde kuluçkalamadan sonra, deterjan yavaş bir adsorban reçinesi kullanan bir çözme karışımından çıkarılır. Bu tür malzemenin genellikle küçük boncuk halinde şekillendirilir polistiren yapılır. Bunlar nispeten hidrofobik ve lipidler 48 oranla deterjan bağlanması için güçlü bir tercih var. hidrofobik tanelerden ayrılması ve santrifüj kullanılarak açıklık yaptıktan sonra, nanodiscs boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile saflaştırılır. Saflaştırılmış nanodiscs (a titrasyonu için ya da daha fazla oranlarda) eşit molar orandaki bir monotopic membran proteini (ve olası yardımcı faktörler) ile karıştırılır ve r bırakılıreact (15 dakika). TEM ile analiz parlayan taburcu karbon kaplı ızgaralar üzerine numune ul-miktarlarda uygulayarak ve daha sonra NAPT ile negatif boyama yaparak gerçekleştirilir. alikotları TEM ızgaraların uygulandığı zaman, aynı örnek büyük bir değişiklik, denatüre edici olmayan ya da SDS-PAGE jel elektroforezi gibi göre aktivite ölçümleri çeşitli ile analiz için kullanılabilir.

Protocol

Nanodiscs hazırlanması 1. Ekspresyon ve membran iskele protein 8 saflaştırılması, 35 E. coli BL21 içinde His-etiketli MSP1E3D1 (DE3) şişelerde T1R pRARE2 gerginlik ifade eder. 37 ° C'de 50 ug / ml kanamisin ile desteklenmiş LB ortam maddesi ile 50 mL'lik bir gece boyunca başlatıcı kültür hazırlayın. 50 ug / ml kanamisin ile takviye edilmiş müthiş bir broth ortamına 2 L gece boyunca başlatıcı kültür …

Representative Results

önerdiğimiz metot olup, bağlama monotopic membran proteini için membran yüzey sağlamak için nanodiscs hazırlanması bağlıdır. Nanodisc çift katlı lipid içine gömülü herhangi bir transmembran proteini olduğu gibi, nanodiscs burada "boş nanodiscs" (Şekil 2A) olarak ifade edilmiştir. Bu iki MSP1E3D1 iskele proteinleri ve POPC 8 yaklaşık 260 molekül bir kompozisyon için 256 kDa bir hesaplanmış molekül ağırlığ?…

Discussion

Boş nanodiscs yeniden oluşturulması, protein nanodisc komplekslerinin hazırlanması ve bu komplekslerin TEM için negatif boyama: Yöntem, üç bölüme ayrılabilir. Her bölüm tekniği, kritik adımlar ve kullanışlı değişiklikler sınırlamaları ile ilgili ayrı ayrı ele alınacaktır.

Boş nanodiscs sulandırıldıktan. üretim ve nanodiscs kullanımında kritik adımlar ve sınırlamalar.

Boş nanodiscs hazırlanması için, MSP-to-lipit oranını op…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, desteklerinden dolayı İsveç Araştırma Konseyi, Stockholm İl Konseyi ve KI fonları teşekkür ederiz. MSP ifadesi ve saflaştırılması Karolinska Institutet / SciLifeLab Protein Bilim Core Tesisleri'nde (http://PSF.ki.se) yapıldı. Yazarlar ayrıca, teknik uzmanlık paylaşımı için ve onların zamanında yardım için Dr. Pasi Purhonen ve Dr Mathilda Sjöberg teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Transmission electron microscope: JEOL2100F JEOL
CCD camera Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger Baltec
TEM grid: 400 mesh TAAB GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 Agilent Technologies 5190-2526
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare Life Sciences 17-5172-01
Plasmid:MSP1E3D1 Addgene 20066
Bacteria: BL21DE3 NEB C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose Sigma Aldrich A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 ml GE Healthcare Life Sciences 17-5247-01
Lipid:POPC Avanti polar lipids 850457C 25 mg/ml in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin Bio-Rad 1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm Pall life sciences PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate Sigma Aldrich 31648
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0301
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001
TCEP Sigma Aldrich 646547
Detergent: Sodium cholate hydrate Sigma Aldrich C6445-10G
Sodium Cholate 500 mM Sodium cholate Resuspend in miliQ water and store at -20°C
Lipid Stock 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl Store at 4°C for a week or
Store -80°C for a month, after purging the solution with nitrogen
MSP standard buffer 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mMEDTA Store at 4°C
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer 50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 BN2001 Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer 50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 0.002% Coomassie G-250 BN2002 Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis 4X Sample loading Buffer 50 mM BisTrispH 7.2, 6N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S BN2003 Purchased from Thermofisher Scientific
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer 25 mM Tris-HCl pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1 % (w/v) SDS Inhouse receipe
Denaturaing Electrophoresis 5X Sample loading Buffer 0.05 % (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl pH 6.8, 20 % (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS,10 mM 2-mercaptoethanol Inhouse receipe
Terrific broth Tryptone – 12.0g
Yeast Extract – 24.0g
100 mL 0.17M KH2PO4 and 0.72M K2HPO4
Glycerol – 4 mL		 Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 ml and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kleinschmidt, J. H., Popot, J. L. Folding and stability of integral membrane proteins in amphipols. Arch Biochem Biophys. 564, 327-343 (2014).
  2. Frauenfeld, J., et al. A saposin-lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nat Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  3. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat Struct Mol Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  4. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-Assembly of Discoidal Phospholipid Bilayer Nanoparticles with Membrane Scaffold Proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  5. Jonas, A., Steinmetz, A., Churgay, L. The number of amphipathic alpha-helical segments of apolipoproteins A-I, E, and A-IV determines the size and functional properties of their reconstituted lipoprotein particles. J Biol Chem. 268 (3), 1596-1602 (1993).
  6. Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Eng Des Sel. 23 (11), 843-848 (2010).
  7. Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized phospholipid bilayer nanodiscs facilitate high-resolution structure determination of membrane proteins. J Am Chem Soc. 135 (5), 1919-1925 (2013).
  8. Ritchie, T. K., Duzgunes, N. e. j. a. t., et al. . Methods in Enzymology. 464, 211-231 (2009).
  9. Schuler, M. A., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs as a new tool to examine lipid-protein interactions. Methods Mol Biol. 974, 415-433 (2013).
  10. Nasr, M. L., et al. Membrane phospholipid bilayer as a determinant of monoacylglycerol lipase kinetic profile and conformational repertoire. Protein Sci. 22 (6), 774-787 (2013).
  11. Yokogawa, M., et al. NMR analyses of the interaction between the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) and phosphoinositide embedded in a lipid bilayer. J Biol Chem. 287 (42), 34936-34945 (2012).
  12. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186, 61-67 (2015).
  13. Zhang, P., et al. An Isoform-Specific Myristylation Switch Targets Type II PKA Holoenzymes to Membranes. Structure. 23 (9), 1563-1572 (2015).
  14. Grushin, K., Miller, J., Dalm, D., Stoilova-McPhie, S. Factor VIII organisation on nanodiscs with different lipid composition. Thromb Haemost. 113 (4), 741-749 (2015).
  15. Baylon, J. L., Lenov, I. L., Sligar, S. G., Tajkhorshid, E. Characterizing the membrane-bound state of cytochrome P450 3A4: structure, depth of insertion, and orientation. J Am Chem Soc. 135 (23), 8542-8551 (2013).
  16. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Oncogenic and RASopathy-associated K-RAS mutations relieve membrane-dependent occlusion of the effector-binding site. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6625-6630 (2015).
  17. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Membrane-dependent modulation of the mTOR activator Rheb: NMR observations of a GTPase tethered to a lipid-bilayer nanodisc. J Am Chem Soc. 135 (9), 3367-3370 (2013).
  18. Wang, L., Sigworth, F. J. Structure of the BK potassium channel in a lipid membrane from electron cryomicroscopy. Nature. 461 (7261), 292-295 (2009).
  19. Ackerson, C. J., Powell, R. D., Hainfeld, J. F. Site-specific biomolecule labeling with gold clusters. Methods Enzymol. 481, 195-230 (2010).
  20. Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (31), 11509-11514 (2006).
  21. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. Membrane protein structure determination – the next generation. Biochim Biophys Acta. 1838 (1 Pt A), 78-87 (2014).
  22. Dias, D. M., Ciulli, A. NMR approaches in structure-based lead discovery: recent developments and new frontiers for targeting multi-protein complexes. Prog Biophys Mol Biol. 116 (2-3), 101-112 (2014).
  23. Viegas, A., Viennet, T., Etzkorn, M. The power, pitfalls and potential of the nanodisc system for NMR-based studies. Biol Chem. , (2016).
  24. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  25. Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy (Oxf). 65 (1), 35-41 (2016).
  26. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  27. De Carlo, S., Adrian, M., Kalin, P., Mayer, J. M., Dubochet, J. Unexpected property of trehalose as observed by cryo-electron microscopy. J Microsc. 196 (1), 40-45 (1999).
  28. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nat Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  29. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
  30. Forte, T. M., Nordhausen, R. W. Electron microscopy of negatively stained lipoproteins. Methods Enzymol. 128, 442-457 (1986).
  31. Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
  32. Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. J Lipid Res. 52 (1), 175-184 (2011).
  33. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  34. Matz, C. E., Jonas, A. Micellar complexes of human apolipoprotein A-I with phosphatidylcholines and cholesterol prepared from cholate-lipid dispersions. J Biol Chem. 257 (8), 4535-4540 (1982).
  35. Kumar, R. B., et al. Structural and Functional Analysis of Calcium Ion Mediated Binding of 5-Lipoxygenase to Nanodiscs. PLoS One. 11 (3), e0152116 (2016).
  36. Waggoner, T. A., Last, J. A., Kotula, P. G., Sasaki, D. Y. Self-assembled columns of stacked lipid bilayers mediated by metal ion recognition. J Am Chem Soc. 123 (3), 496-497 (2001).
  37. Kovacs, E., et al. Analysis of the Role of the C-Terminal Tail in the Regulation of the Epidermal Growth Factor Receptor. Mol Cell Biol. 35 (17), 3083-3102 (2015).
  38. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  39. Zhang, L., Tong, H., Garewal, M., Ren, G. Optimized negative-staining electron microscopy for lipoprotein studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (1), 2150-2159 (2013).
  40. Cong, Y., Ludtke, S. J. Single particle analysis at high resolution. Methods Enzymol. 482, 211-235 (2010).
  41. Radmark, O., Werz, O., Steinhilber, D., Samuelsson, B. 5-Lipoxygenase, a key enzyme for leukotriene biosynthesis in health and disease. Biochim Biophys Acta. 1851 (4), 331-339 (2015).
  42. Anwar, Y., Sabir, J. S., Qureshi, M. I., Saini, K. S. 5-lipoxygenase: a promising drug target against inflammatory diseases-biochemical and pharmacological regulation. Curr Drug Targets. 15 (4), 410-422 (2014).
  43. Radmark, O., Samuelsson, B. Regulation of the activity of 5-lipoxygenase, a key enzyme in leukotriene biosynthesis. Biochem Biophys Res Commun. 396 (1), 105-110 (2010).
  44. Noguchi, M., Miyano, M., Matsumoto, T., Noma, M. Human 5-lipoxygenase associates with phosphatidylcholine liposomes and modulates LTA4 synthetase activity. Biochim Biophys Acta. 1215 (3), 300-306 (1994).
  45. Pande, A. H., Qin, S., Tatulian, S. A. Membrane fluidity is a key modulator of membrane binding, insertion, and activity of 5-lipoxygenase. Biophys J. 88 (6), 4084-4094 (2005).
  46. Pande, A. H., et al. Modulation of human 5-lipoxygenase activity by membrane lipids. Biochemistry. 43 (46), 14653-14666 (2004).
  47. Wong, A., Hwang, S. M., Cook, M. N., Hogaboom, G. K., Crooke, S. T. Interactions of 5-lipoxygenase with membranes: studies on the association of soluble enzyme with membranes and alterations in enzyme activity. Biochemistry. 27 (18), 6763-6769 (1988).
  48. Rigaud, J. L., Levy, D., Mosser, G., Lambert, O. Detergent removal by non-polar polystyrene beads. European Biophysics Journal. 27 (4), 305-319 (1998).
  49. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  50. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  51. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).
  52. Hornschemeyer, P., Liss, V., Heermann, R., Jung, K., Hunke, S. Interaction Analysis of a Two-Component System Using Nanodiscs. PLoS One. 11 (2), 0149187 (2016).
  53. Degrip, W. J., Vanoostrum, J., Bovee-Geurts, P. H. Selective detergent-extraction from mixed detergent/lipid/protein micelles, using cyclodextrin inclusion compounds: a novel generic approach for the preparation of proteoliposomes. Biochem J. 330 (Pt 2), 667-674 (1998).
  54. Martin, D. D., Budamagunta, M. S., Ryan, R. O., Voss, J. C., Oda, M. N. Apolipoprotein A-I assumes a "looped belt" conformation on reconstituted high density lipoprotein. J Biol Chem. 281 (29), 20418-20426 (2006).
  55. Cerione, R. A., Ross, E. M. Reconstitution of receptors and G proteins in phospholipid vesicles. Methods Enzymol. 195, 329-342 (1991).
  56. Shaw, A. W., McLean, M. A., Sligar, S. G. Phospholipid phase transitions in homogeneous nanometer scale bilayer discs. FEBS Lett. 556 (1-3), 260-264 (2004).
  57. Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  58. Civjan, N. R., Bayburt, T. H., Schuler, M. A., Sligar, S. G. Direct solubilization of heterologously expressed membrane proteins by incorporation into nanoscale lipid bilayers. Biotechniques. 35 (3), 553-562 (2003).
  59. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A step-by-step method for the reconstitution of an ABC transporter into nanodisc lipid particles. J Vis Exp. (66), e3910 (2012).
  60. Brooks, S. P., Storey, K. B. Bound and determined: a computer program for making buffers of defined ion concentrations. Anal Biochem. 201 (1), 119-126 (1992).
  61. Gilbert, N. C., et al. The structure of human 5-lipoxygenase. Science. 331 (6014), 217-219 (2011).
  62. Radmark, O. 5-lipoxygenase-derived leukotrienes: mediators also of atherosclerotic inflammation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (7), 1140-1142 (2003).
  63. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. 534 (7607), 347-351 (2016).
  64. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).

Tags

Membrane ProteinsTransmission Electron MicroscopyNanodiscMSP1E3D1POPCSodium CholateProtein-membrane InteractionDrug DevelopmentStructural Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H., Jegerschöld, C. Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55148, doi:10.3791/55148 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image