JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Published: March 05, 2017
doi:
10.3791/55148
, , ,
1Department of Biosciences and Nutrition,Karolinska Institutet, 2School of Technology and Health,KTH Royal Institute of Technology

Summary

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Abstract

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Introduction

במחקר רפואי, תשומת לב רבה מתמקדת חלבונים בממברנה, או פנימיים או חיצוניים, מעורבים במגוון אינטראקציות שומנים. עבודה עם חלבונים אינטראקציה השומנים כולל גם בחירת תחליף ליפידים, כגון חומרי ניקוי, amphipols 1, או חלבונים קטנים 2, או למצוא תחליף קרום שמחזיק את חלבון מסיס ופעיל. תחליפי קרום ליפואית כוללים ליפוזומים nanodiscs (ND) 3, 4.

Nanodiscs הם פלטפורמות הממברנה כמעט טבעיות שפותחה על ידי הנדסה חלק חלבון, ApoA-1, של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) טבעי בדם. ApoA-1 הנו רשת 243 שאריות-ארוכה של סלילים-α amphipathic קצרים ויש לו קונפורמציה מסיס ליפיד חינם. במבחנה כאשר בנוכחות של שומנים, שני עותקים של חלבון ApoA-1 לסדר מחדש באופן ספונטני לכתר את hydrחלק בשרשרת acyl ophobic של תיקון bilayer השומנים 5. גרסאות תכנון הנדסי של ApoA-1 נקראים בדרך כלל חלבונים פיגומים הממברנה (MSP), ואת מספר גדל והולך זמינים מסחרית כמו פלסמידים או חלבונים מטוהרים. חזרות או השמטות של הסלילים-α ב תוצאת ApoA-1 ב 6 ארוכים או קצרים 7 חלבונים בממברנה פיגומים. זה בתורו מאפשר ליצור דיסקים סביב 6 ננומטר 7 עד 17 ננומטר 8 קוטר. ישנם סוגים שונים של יישומים עבור nanodiscs 3, 9. היישום הנפוץ ביותר הוא לספק סביבת קרום כמעט טבעית לייצוב של חלבון ממברנלי אינטגרלי 8, ביקורת בעבר 3, 9. אחד משימושים פחות בחנו הם לספק משטח הממברנה ננו לחקר חלבוני פריפרית קרום 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. סעיף 1 של פרוטוקול להלן ממחיש את ההליך להכנת nanodiscs מורכב פוספוליפידים וחלבונים פיגומים הממברנה.

הכנת מדגם היא צוואר בקבוק ברוב השיטות. דגימות שיטה ספציפית עשויות להוסיף מידע מסוים, אבל הם גם עושים השוואות של תוצאות קשות. לכן, זה פשוט יותר כאשר הדגימות הן multimodal וניתן להשתמש בו ישירות בכמה שיטות שונות. אחד היתרונות עם השימוש nanodiscs הוא גודלו הקטן של nanodisc בהשוואה ליפוזומים (למשל, דגימות יכול לשמש ישירות לשני TEM ו ג'ל אלקטרופורזה הלא denaturing, כמו בפרוטוקול הנוכחי).

<p class = "jove_content"> שלפוחית ​​ו ליפוזומים כבר מזמן השתמשו להבין את תפקידם של חלבונים אינטראקציה-קרום. עבור מחקרים מבניים להדמיה, דוגמא של הנחישות המבנית של חלבון טראנסממברנלי ב ליפוזומים היא 18 זמין. עם זאת, אין מבנה 3D ברזולוציה גבוהה של חלבון הממברנה monotopic מוטבע על קרום ליפוזום פורסמה עדיין, ככל שאנו יודעים. חלקיקים או נוגדני זהב יכולים לשמש כדי לחזות חלבונים מחייבים ליפוזומים או שלפוחית באמצעות 19 TEM. למרות בדיקות אלה הם מאוד ספציפיים, שהם עלולים להפריע לתהליך חלבונים קושרי הממברנה על ידי מיסוך באתר קרום מחייב או על ידי מיסוך תחומי העניין עם החלקים גמישים. זהב שכותרתו או חלבונים ומורכבי נוגדן בטח יכולים להיות מנותח על ג'ל, אבל זה יגדיל את עלות הניסוי.

למרות ליפוזומים הם פלטפורמה מצוינת, אחד לא יכול להיות בטוח כי פופיש ulation יחס מסוים של חלבון לכל liposome, תכונה שיכולה להיחקר על ידי שימוש nanodiscs 20. בשנת ליפוזום, קו-פקטורי מצעים יכולים להיות לכוד בפנים המסיס. חומרים שהם קרום מסיסים יחלקו את אותו גורל לשני סוגי mimetics הממברנה. אף על פי כן, כמו אזור bilayer קטן ב nanodiscs, כמות קטנה יותר של חומר נדרשה כדי להרוות את קרומי nanodisc.

תפקוד החלבון הבנת דרך קביעת המבנה האטומי כבר חיוני בתחומים רבים של מחקר. שיטות לקביעת מבנה חלבון כוללות רנטגן 21; תהודה מגנטית גרעינית (NMR) 22, 23; במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) 24 בקירור, cryoEM. ההחלטה על ידי cryoEM לאחרונה שופרה מאוד, בעיקר בשל השימוש של דה אלקטרון הישירtectors 25, 26. מקרומולקולות הם צלמו רזה, קרח זגוגי 27 במצב כמעט טבעי. עם זאת, בגלל הקונטרסט הנמוך של מולקולות ביולוגיות, הם הופכים קשים לזהות בטווח הגודל של 100 – 200 kDa. לקבלת דוגמיות בגודל המתאים, איסוף נתונים יכול להתבצע ואת שיטת שחזור חלקיק בודד יכולה להיות מיושמת כדי להשיג מבנה 28.

עם זאת, קביעת מבנה החלבון על ידי TEM הוא תהליך רב שלבי. זה מתחיל בדרך כלל עם ההערכה של מדגם monodispersity ב -29 שלילי כתם TEM באמצעות מלחים של מתכות כבדות כמו phosphotungsten (PT) 30 או אורניום 31. שחזור של מודל ברזולוציה נמוכה של מקרומולקולה המוכתמת שלילי עשוי בדרך כלל ועלול להניב מידע חשוב על המבנה המולקולרי 29. במקביל,איסוף נתונים באמצעות cryoEM יכול להתחיל. יש להקפיד בעת הערכת נתוני TEM השלילית-כתם, כדי למנוע את הפרשנות השגויה של היווצרות artefact. Artefact אחד מסוים הוא ההשפעה של כתם PT על פוספוליפידים ליפוזומים 32, וכתוצאה מכך ההיווצרות של מוטות ארוכות דומות ערימות של מטבעים במבט מהצד 33. "רולו" או "ערימות" כזה (להלן מסומן כמו "ערימות") נצפו בשלב מוקדם עבור HDL 34, ומאוחר יותר גם עבור nanodiscs 35.

ההערמה והעיצוב מחדש של ממברנות עלולות להתרחש מסיבות רבות. לדוגמה, זה יכול להיגרם על ידי שיתוף גורמים כמו נחושת, שמוצג על ידי הדמיה TEM ב כתם אמוניום molybdate 36. שבריר של ליפידים קרום ליפוזומים כלול לקבוצת ראש חומצת iminodiacetic מחק complexation מתכת ידי EDTA, ובכך לערום ליפוזומים לאחר התוספת של יוני נחושת <sעד class = "Xref"> 36. הנחת יכול להיות גם עקב אינטראקציה בין חלבונים על ידי חלבון או על bilayers שומנים בדם (הכתם בשימוש אינו מוזכר) 37. היווצרות ערימה של פוספוליפידים ידי PT נצפתה בשלב מוקדם; עם זאת, עבודה לאחר מכן התמקדה סר או ביטול היווצרות חפץ זה 38.

כאן, אנו מציעים שיטה לנצל את nanodisc NAPT הנגרמת לערום לחקר חלבונים קושרי קרום ידי TEM. בקיצור, חלבון מחייב על nanodiscs שימנע nanodiscs מן הערמה. למרות הסיבות לערום אינן ברורות, הוצע 39 כי קיימת אינטראקציה אלקטרוסטטית בין פוספוליפידים וקבוצת phosphoryl של PT, בגרימת הדיסקים לדבוק כל (איור 1 א) אחר. ההנחה העומדת מאחורי פרוטוקול שלנו היא שכאשר חלבון נקשר nanodisc, רוב השטח פוספוליפידים אינו availa ble לאינטראקציה עם PT עקב הפרעה סטרית ידי החלבון. זה ימנע היווצרות מחסנית (איור 1B). שתי מסקנות אפשר להסיק. ראשית, המניעה לערום כלומר החלבון של העניין הכפיף אותו הקרום. שנית, מורכב החלבון-ND יכול להיות מטופלים עם שיטות עיבוד יחיד חלקיקי תקן 24, 40 לקבל מורפולוגיה מחוספסת של המתחם. יתר על כן, מנתח בשיטות כמו ג'ל אלקטרופורזה הלא denaturing או פיזור אור דינאמי יכול להתבצע.

כדי להדגים את ההשערה הזו, השתמשנו החלבון קושר קרום 5 lipoxygenase (5LO), העוסק במחלות רבות דלקתיות 41, 42. חלבון 78-kDa זה דורש יוני סידן להיקשר הממברנה שלה 43. למרות עמותת קרום זה נחקרה באמצעות בהרחבה ליפוזומיםs = "Xref"> 44, 45, 46 ו שברי קרום 47, אלה לא יכולים לשמש לניתוח TEM ונחישות מבנה.

הכנת nanodiscs מתחיל ידי ערבוב MSP עם השומנים resuspended ב cholate נתרן חומר ניקוי. לאחר דגירה על קרח למשך 1 שעות, אבקת הכביסה מוסרת לאט מתערובת הכינון מחדש תוך שימוש בשרף כושר ספיג. סוג של חומר זה עשוי לעתים קרובות קלקר בצורת לתוך חרוזים קטנים. הם יחסית הידרופובי יש העדפה חזקה מחייב דטרגנט לעומת שומנים 48. לאחר הסרת חרוזים הידרופובי וביצוע בירור באמצעות צנטריפוגה, nanodiscs הם מטוהרים על ידי כרומטוגרפיה הדרה גודל (SEC). Nanodiscs מטוהר מעורבב עם חלבון הממברנה monotopic (ורכיבים אפשריים) ב יחס equimolar (או יחסי מספר עבור טיטרציה) והם עזבו כדי react (15 דק '). ניתוח על פי TEM מתבצע על ידי החלת μL-סכומי המדגם על-משוחרר זוהרת, רשתות מצופות הפחם ולאחר מכן על ידי ביצוע מכתים שלילי עם NAPT. מדגם זהה וממתי aliquots הוחלו על רשתות TEM יכול לשמש לניתוח על ידי הלא denaturing או SDS עמוד-ג'ל אלקטרופורזה, כמו גם על ידי סוגים שונים של מדידות פעילות, ללא שינויים משמעותיים.

Protocol

1. הכנת Nanodiscs ביטוי וטיהור של פיגומי קרום החלבון 8, 35 לבטא את MSP1E3D1 שלו מתויג ב BL21 E. coli (DE3) זן T1R pRARE2 צלוחיות. הכן תרבות המתנע לילה 50 מ"?…

Representative Results

השיטה שאנו מציעים תלויה בהכנת nanodiscs לספק משטח הממברנה עבור monotopic קרום חלבון מחייב. מאחר ואין חלבון טראנסממברנלי מוטבע לתוך bilayer השומנים nanodisc, את nanodiscs הם כאן מסומן כמו "nanodiscs ריק" (איור 2 א). אלה יש משקל מולקולרי מחושב של 256 kDa עבור רכב שני ח?…

Discussion

השיטה ניתן לחלק לשלושה חלקים: הכינון מחדש של nanodiscs ריק, הכנת קומפלקסים חלבונים-nanodisc, ואת מכתים שלילי עבור TEM קומפלקסים אלה. כל חלק יטופל בנפרד בקשר להגבלות על הטכניקה, השלבים קריטיים, ושינויים שימושיים.

כינון של nanodiscs ריק. שלבים ומגבל…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים המחקר השבדי המועצה, מועצת מחוז שטוקהולם, וקרנות KI על תמיכתם. הביטוי וטיהור MSP בוצע במתקן Core קרולינסקה Institutet / SciLifeLab חלבון המדע (http://PSF.ki.se). המחברים גם רוצה להודות לד"ר Pasi Purhonen וד"ר מתילדה סיוברג על שיתוף המומחיות הטכנית שלהם לסיוע בזמן שלהם.

Materials

Transmission electron microscope: JEOL2100F JEOL
CCD camera Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger Baltec
TEM grid: 400 mesh TAAB GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 Agilent Technologies 5190-2526
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare Life Sciences 17-5172-01
Plasmid:MSP1E3D1 Addgene 20066
Bacteria: BL21DE3 NEB C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose Sigma Aldrich A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 ml GE Healthcare Life Sciences 17-5247-01
Lipid:POPC Avanti polar lipids 850457C 25 mg/ml in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin Bio-Rad 1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm Pall life sciences PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate Sigma Aldrich 31648
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0301
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001
TCEP Sigma Aldrich 646547
Detergent: Sodium cholate hydrate Sigma Aldrich C6445-10G
Sodium Cholate 500 mM Sodium cholate Resuspend in miliQ water and store at -20°C
Lipid Stock 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl Store at 4°C for a week or
Store -80°C for a month, after purging the solution with nitrogen
MSP standard buffer 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mMEDTA Store at 4°C
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer 50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 BN2001 Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer 50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 0.002% Coomassie G-250 BN2002 Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis 4X Sample loading Buffer 50 mM BisTrispH 7.2, 6N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S BN2003 Purchased from Thermofisher Scientific
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer 25 mM Tris-HCl pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1 % (w/v) SDS Inhouse receipe
Denaturaing Electrophoresis 5X Sample loading Buffer 0.05 % (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl pH 6.8, 20 % (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS,10 mM 2-mercaptoethanol Inhouse receipe
Terrific broth Tryptone – 12.0g
Yeast Extract – 24.0g
100 mL 0.17M KH2PO4 and 0.72M K2HPO4
Glycerol – 4 mL		 Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 ml and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kleinschmidt, J. H., Popot, J. L. Folding and stability of integral membrane proteins in amphipols. Arch Biochem Biophys. 564, 327-343 (2014).
  2. Frauenfeld, J., et al. A saposin-lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nat Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  3. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat Struct Mol Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  4. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-Assembly of Discoidal Phospholipid Bilayer Nanoparticles with Membrane Scaffold Proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  5. Jonas, A., Steinmetz, A., Churgay, L. The number of amphipathic alpha-helical segments of apolipoproteins A-I, E, and A-IV determines the size and functional properties of their reconstituted lipoprotein particles. J Biol Chem. 268 (3), 1596-1602 (1993).
  6. Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Eng Des Sel. 23 (11), 843-848 (2010).
  7. Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized phospholipid bilayer nanodiscs facilitate high-resolution structure determination of membrane proteins. J Am Chem Soc. 135 (5), 1919-1925 (2013).
  8. Ritchie, T. K., Duzgunes, N. e. j. a. t., et al. . Methods in Enzymology. 464, 211-231 (2009).
  9. Schuler, M. A., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs as a new tool to examine lipid-protein interactions. Methods Mol Biol. 974, 415-433 (2013).
  10. Nasr, M. L., et al. Membrane phospholipid bilayer as a determinant of monoacylglycerol lipase kinetic profile and conformational repertoire. Protein Sci. 22 (6), 774-787 (2013).
  11. Yokogawa, M., et al. NMR analyses of the interaction between the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) and phosphoinositide embedded in a lipid bilayer. J Biol Chem. 287 (42), 34936-34945 (2012).
  12. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186, 61-67 (2015).
  13. Zhang, P., et al. An Isoform-Specific Myristylation Switch Targets Type II PKA Holoenzymes to Membranes. Structure. 23 (9), 1563-1572 (2015).
  14. Grushin, K., Miller, J., Dalm, D., Stoilova-McPhie, S. Factor VIII organisation on nanodiscs with different lipid composition. Thromb Haemost. 113 (4), 741-749 (2015).
  15. Baylon, J. L., Lenov, I. L., Sligar, S. G., Tajkhorshid, E. Characterizing the membrane-bound state of cytochrome P450 3A4: structure, depth of insertion, and orientation. J Am Chem Soc. 135 (23), 8542-8551 (2013).
  16. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Oncogenic and RASopathy-associated K-RAS mutations relieve membrane-dependent occlusion of the effector-binding site. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6625-6630 (2015).
  17. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Membrane-dependent modulation of the mTOR activator Rheb: NMR observations of a GTPase tethered to a lipid-bilayer nanodisc. J Am Chem Soc. 135 (9), 3367-3370 (2013).
  18. Wang, L., Sigworth, F. J. Structure of the BK potassium channel in a lipid membrane from electron cryomicroscopy. Nature. 461 (7261), 292-295 (2009).
  19. Ackerson, C. J., Powell, R. D., Hainfeld, J. F. Site-specific biomolecule labeling with gold clusters. Methods Enzymol. 481, 195-230 (2010).
  20. Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (31), 11509-11514 (2006).
  21. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. Membrane protein structure determination – the next generation. Biochim Biophys Acta. 1838 (1 Pt A), 78-87 (2014).
  22. Dias, D. M., Ciulli, A. NMR approaches in structure-based lead discovery: recent developments and new frontiers for targeting multi-protein complexes. Prog Biophys Mol Biol. 116 (2-3), 101-112 (2014).
  23. Viegas, A., Viennet, T., Etzkorn, M. The power, pitfalls and potential of the nanodisc system for NMR-based studies. Biol Chem. , (2016).
  24. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  25. Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy (Oxf). 65 (1), 35-41 (2016).
  26. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  27. De Carlo, S., Adrian, M., Kalin, P., Mayer, J. M., Dubochet, J. Unexpected property of trehalose as observed by cryo-electron microscopy. J Microsc. 196 (1), 40-45 (1999).
  28. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nat Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  29. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
  30. Forte, T. M., Nordhausen, R. W. Electron microscopy of negatively stained lipoproteins. Methods Enzymol. 128, 442-457 (1986).
  31. Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
  32. Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. J Lipid Res. 52 (1), 175-184 (2011).
  33. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  34. Matz, C. E., Jonas, A. Micellar complexes of human apolipoprotein A-I with phosphatidylcholines and cholesterol prepared from cholate-lipid dispersions. J Biol Chem. 257 (8), 4535-4540 (1982).
  35. Kumar, R. B., et al. Structural and Functional Analysis of Calcium Ion Mediated Binding of 5-Lipoxygenase to Nanodiscs. PLoS One. 11 (3), e0152116 (2016).
  36. Waggoner, T. A., Last, J. A., Kotula, P. G., Sasaki, D. Y. Self-assembled columns of stacked lipid bilayers mediated by metal ion recognition. J Am Chem Soc. 123 (3), 496-497 (2001).
  37. Kovacs, E., et al. Analysis of the Role of the C-Terminal Tail in the Regulation of the Epidermal Growth Factor Receptor. Mol Cell Biol. 35 (17), 3083-3102 (2015).
  38. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  39. Zhang, L., Tong, H., Garewal, M., Ren, G. Optimized negative-staining electron microscopy for lipoprotein studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (1), 2150-2159 (2013).
  40. Cong, Y., Ludtke, S. J. Single particle analysis at high resolution. Methods Enzymol. 482, 211-235 (2010).
  41. Radmark, O., Werz, O., Steinhilber, D., Samuelsson, B. 5-Lipoxygenase, a key enzyme for leukotriene biosynthesis in health and disease. Biochim Biophys Acta. 1851 (4), 331-339 (2015).
  42. Anwar, Y., Sabir, J. S., Qureshi, M. I., Saini, K. S. 5-lipoxygenase: a promising drug target against inflammatory diseases-biochemical and pharmacological regulation. Curr Drug Targets. 15 (4), 410-422 (2014).
  43. Radmark, O., Samuelsson, B. Regulation of the activity of 5-lipoxygenase, a key enzyme in leukotriene biosynthesis. Biochem Biophys Res Commun. 396 (1), 105-110 (2010).
  44. Noguchi, M., Miyano, M., Matsumoto, T., Noma, M. Human 5-lipoxygenase associates with phosphatidylcholine liposomes and modulates LTA4 synthetase activity. Biochim Biophys Acta. 1215 (3), 300-306 (1994).
  45. Pande, A. H., Qin, S., Tatulian, S. A. Membrane fluidity is a key modulator of membrane binding, insertion, and activity of 5-lipoxygenase. Biophys J. 88 (6), 4084-4094 (2005).
  46. Pande, A. H., et al. Modulation of human 5-lipoxygenase activity by membrane lipids. Biochemistry. 43 (46), 14653-14666 (2004).
  47. Wong, A., Hwang, S. M., Cook, M. N., Hogaboom, G. K., Crooke, S. T. Interactions of 5-lipoxygenase with membranes: studies on the association of soluble enzyme with membranes and alterations in enzyme activity. Biochemistry. 27 (18), 6763-6769 (1988).
  48. Rigaud, J. L., Levy, D., Mosser, G., Lambert, O. Detergent removal by non-polar polystyrene beads. European Biophysics Journal. 27 (4), 305-319 (1998).
  49. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  50. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  51. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).
  52. Hornschemeyer, P., Liss, V., Heermann, R., Jung, K., Hunke, S. Interaction Analysis of a Two-Component System Using Nanodiscs. PLoS One. 11 (2), 0149187 (2016).
  53. Degrip, W. J., Vanoostrum, J., Bovee-Geurts, P. H. Selective detergent-extraction from mixed detergent/lipid/protein micelles, using cyclodextrin inclusion compounds: a novel generic approach for the preparation of proteoliposomes. Biochem J. 330 (Pt 2), 667-674 (1998).
  54. Martin, D. D., Budamagunta, M. S., Ryan, R. O., Voss, J. C., Oda, M. N. Apolipoprotein A-I assumes a "looped belt" conformation on reconstituted high density lipoprotein. J Biol Chem. 281 (29), 20418-20426 (2006).
  55. Cerione, R. A., Ross, E. M. Reconstitution of receptors and G proteins in phospholipid vesicles. Methods Enzymol. 195, 329-342 (1991).
  56. Shaw, A. W., McLean, M. A., Sligar, S. G. Phospholipid phase transitions in homogeneous nanometer scale bilayer discs. FEBS Lett. 556 (1-3), 260-264 (2004).
  57. Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  58. Civjan, N. R., Bayburt, T. H., Schuler, M. A., Sligar, S. G. Direct solubilization of heterologously expressed membrane proteins by incorporation into nanoscale lipid bilayers. Biotechniques. 35 (3), 553-562 (2003).
  59. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A step-by-step method for the reconstitution of an ABC transporter into nanodisc lipid particles. J Vis Exp. (66), e3910 (2012).
  60. Brooks, S. P., Storey, K. B. Bound and determined: a computer program for making buffers of defined ion concentrations. Anal Biochem. 201 (1), 119-126 (1992).
  61. Gilbert, N. C., et al. The structure of human 5-lipoxygenase. Science. 331 (6014), 217-219 (2011).
  62. Radmark, O. 5-lipoxygenase-derived leukotrienes: mediators also of atherosclerotic inflammation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (7), 1140-1142 (2003).
  63. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. 534 (7607), 347-351 (2016).
  64. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).

Tags

Membrane ProteinsTransmission Electron MicroscopyNanodiscMSP1E3D1POPCSodium CholateProtein-membrane InteractionDrug DevelopmentStructural Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H., Jegerschöld, C. Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55148, doi:10.3791/55148 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image