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Biochemistry

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

Published: March 05, 2017
doi:
10.3791/55148
, , ,
1Department of Biosciences and Nutrition,Karolinska Institutet, 2School of Technology and Health,KTH Royal Institute of Technology

Summary

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Abstract

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Introduction

의학 연구에 많은 관심이 지질 상호 작용의 다양한 관련된 진성 또는 외부 중 막 단백질에 초점을 맞추고있다. 지질 상호 작용하는 단백질과 작업 중 하나가, 세제 등의 지질에 대체를 선택 1 amphipols, 또는 작은 단백질 2, 또는 수용성 활성 단백질을 유지하는 막 대용품을 찾는 포함되어 있습니다. 리포 막 대체는 리포좀과 nanodiscs (ND) 3, 4를 포함한다.

Nanodiscs 당연히 혈액에서 발생하는 고밀도 지단백질 (HDL)의 단백질의 일부 ​​ApoA-1 엔지니어링 개발 가까운 천연 막 플랫폼이다. ApoA-1은 짧은 양친 매성 α-나선의 243 잔류 긴 체인 및 지질없는 수용성 형태가 있습니다. 시험관 내에서의 지질의 존재 하에서, 단백질 ApoA-1 개의 카피 자발적 히드을 둘러싸 재정렬 때지질 이중층 패치 5 ophobic 아실 사슬 부분. ApoA-1의 엔지니어링 버전은 일반적으로 멤브레인 비계 단백질 (MSP)라고하고, 증가는 플라스미드이나 정제 단백질과 같은 시판되고있다. 6 길거나 짧은 7 막 비계 단백질 ApoA-1 결과에 반복 또는 α-나선의 삭제. 차례로 이로써 7 8 내지 17 6nm의 주위 디스크를 형성 할 수있다. nanodiscs 3, 9 응용 프로그램의 다른 유형이있다. 가장 일반적으로 사용되는 애플리케이션이 이전 3 구 검토 일체 세포막 단백질 (8)의 안정화를위한 니어 – 네이티브 막 환경을 제공하는 것이다. 덜 탐구 이용의 연구 나노 멤브레인 표면을 제공하는 것이다말초 막 단백질 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. 프로토콜의 제 1은 인지질 막 단백질 폴딩 이루어지는 nanodiscs의 제조 과정을 시각화한다.

샘플 준비는 대부분의 방법에서 병목 현상입니다. 방법 별 샘플은 특정 정보를 추가 할 수 있습니다,하지만 그들은 또한 결과의 비교를 어렵게 만든다. 샘플 복합있는 여러 가지 방법에 직접 사용할 수있는 경우에 따라서, 간단하다. nanodiscs의 사용과 장점은 리포좀 (예를 들어, 샘플을 직접 본 프로토콜에서와 같이, TEM 및 비 – 변성 겔 전기 영동에 모두 사용될 수 있음)에 비교하여 나노 디스크의 작은 크기이다.

<p clasS = "jove_content는"> 리포좀 소포 긴 막 – 상호 작용 단백질의 기능을 이해하기 위해 사용되어왔다. 구조의 연구 및 시각화를 들어, 리포좀의 막 관통 단백질의 구조 결정의 예는 가능한 18이다. 그러나, 리포좀 막에 포함 된 monotopic 막 단백질의 더 높은 해상도의 3D 구조는 우리가 아는까지로, 아직 게시되지 않았습니다. 금 나노 입자는 항체 또는 TEM (19)을 사용하여 리포솜 소낭 또는 결합 단백질을 가시화하기 위해 사용될 수있다. 이 프로브는 매우 특정한 비록 그들이 막 결합 부위를 베일로 덮기하거나 유연한 부분과 관심 영역을 마스킹함으로써 막 – 결합 단백질을 방해 할 수있다. 골드 표지 또는 항체 복합체 단백질은 아마 겔에서 분석 할 수 있지만,이 실험의 비용을 증가시킬 것이다.

리포좀이 뛰어난 플랫폼 비록, 하나는 팝업이 확신 할 수 없다위험률은 리포좀 당 단백질의 특정 비율, nanodiscs (20)를 사용하여 탐색 할 수있는 기능이 있습니다. 리포좀에서, 보조 인자 및 기판 수용성 내부에 트랩 될 수있다. 막 용해 물질은 막 모방 체의 두 가지 유형에 대해 동일한 운명을 공유합니다. 이중층 영역 nanodiscs 작다 그럼에도 불구하고, 약물의 적은 양의 나노 디스크 막을 포화 요구된다.

원자 구조의 결정을 통해 이해 단백질의 기능 연구의 많은 분야에 대해 필수였다. 단백질 구조 결정하는 방법은 X 선 (21)을 포함한다; 핵 자기 공명 (NMR) 22, 23; 및 투과형 전자 현미경 (TEM) 저온에서 24 cryoEM. cryoEM에서 해상도가 최근 크게 주로 직접적인 전자 드의 사용으로 개선 된26, 25 tectors. 거대 분자는 거의 원시 상태에서 얇은, 유리체 얼음 27 군데 있습니다. 200 kDa의 – 그러나, 생체 분자의 낮은 대비로 인해, 그들 (100)의 크기의 범위가 검출하기 어려운된다. 적절한 크기의 샘플은 데이터를 수집 할 수 있고, 하나의 입자의 재구성 방법은 구조물 (28)을 얻기 위해 적용될 수있다.

그러나, TEM에 의한 단백질 구조의 측정은 다단계 과정이다. 그것은 일반적으로 부정적인 얼룩 TEM (29) phosphotungsten (PT) 30 우라늄 (31)과 같은 중금속을 사용하여 샘플 단 분산의 평가로 시작합니다. 음으로 염색 고분자의 저해상도 모델의 재구성은 일반적으로 이루어지고, 분자 구조 (29)에 대한 중요한 정보를 산출 할 수있다. 병행하여,cryoEM 시작할 수 있습니다 사용하여 데이터 수집. 인위 형성 오해를 방지하기 위해 네거티브 얼룩 TEM 데이터를 평가할 때주의를 기울여야한다. 한 특정의 인공물은 인지질의 PT 얼룩의 효과와 측면 (33)에서 본 동전의 스택을 닮은 긴 막대의 형성의 결과로, 32 리포솜. 이러한 "ROULEAU"또는 "스택"(이하 "스택"으로 표시됨) nanodiscs 35 이상 또한 34 HDL 초기에 관찰 하였다.

막의 적재 및 재 형성은 여러 가지 이유로 발생할 수 있습니다. 예를 들면, 암모늄 몰 리브 데이트 얼룩 36 TEM 영상으로 나타낸 구리 등 공동 요인에 의해 유도 될 수있다. 리포좀의 막 지질의 일부분 따라서 구리 이온의 첨가 후 리포좀 스태킹 EDTA하여 금속 착물을 모방 이미 노디 아세트산 머리기를 포함 <s클래스 = "외부 참조"> 36입니다. 스태킹 인해이나 지질 이중층에 의한 단백질의 단백질 – 단백질 상호 작용 될 수있다 (37) (사용 된 스테인 언급되지 않음). PT에 의한 인지질의 스택 형성은 초기에 관찰되었다; 그러나, 나중에 작업을 제거하거나이 이슈 형성 (38) 폐지에 초점을 맞추고있다.

여기서는 TEM에 의해 막 결합 단백질의 연구 적재 NAPT 유도 나노 디스크를 이용할 수있는 방법을 제안한다. 즉, nanodiscs에 결합 단백질은 스택에서 nanodiscs을 방지 할 수 있습니다. 적층에 대한 이유는 명확하지 않지만, 그것은 서로 (도 1A)에 부착하기 위해 디스크를 일으키는 인지질 및 PT의 포스 포릴 그룹 사이의 정전 기적 상호 작용이 있다는 것을 제시 하였다 (39). 우리 프로토콜 뒤에 가설 단백질은 나노 디스크에 결합하면, 인지질 표면의 대부분 availa 없다는 것이다 때문에 단백질에 의한 입체 장애에 대한 PT와 상호 작용 BLE. 이 스택 형성 (그림 1B)를 방지 할 수 있습니다. 두 가지 결론을 그릴 수 있습니다. 우선, 적층 예방 관심있는 단백질은 막에 결합 된 것을 의미한다. 둘째, 단백질 ND 복합체는 복합체의 대략적인 형태를 얻기 위해 표준 단일 입자 처리 방법 (24) (40)로 처리 될 수있다. 또한, 비 – 변성 겔 전기 영동 또는 동적 광 산란과 같은 방법으로 분석을 수행 할 수있다.

이 가설을 입증하기 위해, 우리는 많은 염증성 질환 (41), (42)에 관여하는 막 결합 단백질 5 리폭 시게나 제 (5LO)을 사용했다. 이 78-kDa 단백질은 막 (43)에 결합하는 칼슘 이온을 필요로한다. 이 멤브레인 연관이 조사 된 경우에도 광범위 리포좀을 사용하여S = "외부 참조"> 44, 45, 46, 47의 막 분획, 이러한 TEM 분석과 구조 결정을 위해 사용될 수 없다.

nanodiscs의 제조는 세제 나트륨 콜레이트 재현 탁 MSP 지질과 혼합함으로써 시작한다. 얼음상에서 1 시간 동안 배양 한 후, 세제 서서히 흡착 수지를 이용하여 재구성 된 혼합물로부터 제거된다. 이러한 종류의 재료는 종종 작은 비드로 성형 폴리스티렌 이루어진다. 그들은 상대적으로 소수성 및 지질 (48)에 비해 세제를 바인딩에 대한 강한 선호를 가지고있다. 소수성 비드를 제거하고, 원심 분리를 이용하여 설명을 수행 한 후에는 nanodiscs은 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC)에 의해 정제된다. 정제 nanodiscs은 (a 적정 또는 여러 비) 등몰 비율의 monotopic 막 단백질 (및 가능한 보조 인자)와 혼합하고, (R)에 남아어린애들입니다 사람들을 대피 (15 분). TEM 분석으로는 글로우 방전 탄소 코팅 된 그리드 상에 샘플 μL – 양을 적용하여 다음 NAPT 마이너스 염색을 수행함으로써 수행된다. 분취 액은 TEM 그리드에인가 된 경우에서 동일한 샘플은 별다른 변화 비 변성 또는 SDS의 PAGE 겔 전기 영동뿐만 아니라 의한 활성의 측정 각종 분석을 위해 사용될 수있다.

Protocol

Nanodiscs 1. 준비 식 및 멤브레인 비계 단백질 (8)의 정화 (35) 대장균 BL21에서 그의-태그 MSP1E3D1 (DE3) 플라스크에 T1R pRARE2의 피로를 표현한다. 37 ° C에서 50 μg의 / mL의 카나마이신으로 보충 LB 배지 50 mL의 하룻밤 스타터 문화를 준비합니다. 50 μg의 / mL의 카나마이신으로 보충 훌륭한 국물 매체의이 L에서 하룻밤 스타터 문화를 희석. <…

Representative Results

우리가 제안하는 방법은 결합 monotopic 막 단백질 막 표면을 제공 nanodiscs의 제조 방법에 의존한다. 나노 디스크 지질 이중층에 매립에는 막 관통 단백질이 없을 때, nanodiscs 여기에서 "빈 nanodiscs"(도 2A)로 표시된다. 이 두 MSP1E3D1 비계 단백질과 POPC (8)의 약 260 분자의 조성물 256 kDa의의 계산 된 분자량이있다. 이 단백질 사용 : 재구성을위?…

Discussion

빈 nanodiscs의 재구성, 나노 디스크 단백질 복합체의 제조, 및 이들 복합체의 TEM 용 네가티브 염색 :이 방법은 세 부분으로 분리 될 수있다. 각 부분은 기술, 중요한 단계, 유용한 수정의 한계에 대해 개별적으로 해결 될 것입니다.

빈 nanodiscs의 재구성. 생산과 nanodiscs의 사용에서 중요한 단계 및 제한.

nanodiscs 빈의 제조를위한, 상기 MSP 대 지방의 비율을 최적?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 그들의 지원을 위해 스웨덴 연구위원회, 스톡홀름 카운티위원회, 및 KI 기금 감사합니다. MSP의 발현 및 정제는 카롤린스카 연구소 / SciLifeLab 단백질 과학 핵심 시설에 (http://PSF.ki.se)을 수행 하였다. 저자는 또한 기술 전문 지식을 공유하고 자신의 적시 지원을 위해 박사 파시 Purhonen 박사 마틸다 베르그에게 감사의 말씀을 전합니다.

Materials

Transmission electron microscope: JEOL2100F JEOL
CCD camera Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger Baltec
TEM grid: 400 mesh TAAB GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 Agilent Technologies 5190-2526
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare Life Sciences 17-5172-01
Plasmid:MSP1E3D1 Addgene 20066
Bacteria: BL21DE3 NEB C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose Sigma Aldrich A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 ml GE Healthcare Life Sciences 17-5247-01
Lipid:POPC Avanti polar lipids 850457C 25 mg/ml in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin Bio-Rad 1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm Pall life sciences PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate Sigma Aldrich 31648
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0301
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001
TCEP Sigma Aldrich 646547
Detergent: Sodium cholate hydrate Sigma Aldrich C6445-10G
Sodium Cholate 500 mM Sodium cholate Resuspend in miliQ water and store at -20°C
Lipid Stock 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl Store at 4°C for a week or
Store -80°C for a month, after purging the solution with nitrogen
MSP standard buffer 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mMEDTA Store at 4°C
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer 50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 BN2001 Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer 50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 0.002% Coomassie G-250 BN2002 Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis 4X Sample loading Buffer 50 mM BisTrispH 7.2, 6N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S BN2003 Purchased from Thermofisher Scientific
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer 25 mM Tris-HCl pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1 % (w/v) SDS Inhouse receipe
Denaturaing Electrophoresis 5X Sample loading Buffer 0.05 % (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl pH 6.8, 20 % (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS,10 mM 2-mercaptoethanol Inhouse receipe
Terrific broth Tryptone – 12.0g
Yeast Extract – 24.0g
100 mL 0.17M KH2PO4 and 0.72M K2HPO4
Glycerol – 4 mL		 Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 ml and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium
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References

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B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H., Jegerschöld, C. Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55148, doi:10.3791/55148 (2017).
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