בידוד מהיר של BMPR-IB + השומן שמקורם בתאי סטרומה לשימוש במודל ריפוי פגם calvarial
Summary
Adipose-derived stromal cells may be useful for engineering new tissue from a patient’s own cells. We present a protocol for the isolation of a subpopulation of human adipose-derived stromal cells (ASCs) with increased osteogenic potential, followed by application of the cells in an in vivo calvarial healing assay.
Abstract
Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient’s own body. The ability to grow bone de novo using a patient’s own cells would allow bony defects to be filled with adequate tissue without the morbidity of harvesting native bone. There is interest in the use of adipose-derived stromal cells (ASCs) as a source for tissue engineering because these are obtained from an abundant source: the patient’s own adipose tissue. However, ASCs are a heterogeneous population and some subpopulations may be more effective in this application than others. Isolation of the most osteogenic population of ASCs could improve the efficiency and effectiveness of a bone engineering process. In this protocol, ASCs are obtained from subcutaneous fat tissue from a human donor. The subpopulation of ASCs expressing the marker BMPR-IB is isolated using FACS. These cells are then applied to an in vivo calvarial defect healing assay and are found to have improved osteogenic regenerative potential compared with unsorted cells.
Introduction
פגמי עצם סרן כתוצאה מפגיעה, זיהום, או סרטן פולשני להיות השפעה משמעותית על ההתאוששות ואיכות החיים של מטופל. טכניקות קיימות למלא פגמים אלה עם עצם בריא ממקום אחר בגוף החולה עצמו, אך העברה זו נושאת תחלואה סיכון משלה לסיבוכי 1, 2, 3. יתר על כן, פגמים מסוימים הם כל כך גדולים או מורכבים כי עצם מתורם מספיק גדול אינו זמין כדי למלא את הפגם. פרוטזות הן אפשרות פוטנציאל למילוי פגמים גרמיים אבל אלה קשורים עם מספר חסרונות כולל זיהומים, כשל חומרה, ותגובת גוף זר 4.
מסיבות אלה יש עניין רב באפשרות של הנדסת תחליפי עצם ביולוגי באמצעות תאים של החולה עצמו 5. שומן שמקורם בתאי סטרומה (ASCs)יש פוטנציאל יישום זה כי הם בשפע זמינים ברקמת השומן של החולה עצמו והם הדגימו את היכולת לרפא פגמי עצם על ידי יצירת רקמת עצם חדשה 6, 7. ASCs הוא אוכלוסייה מגוונת של תאים וכמה מחקרים הראתה כי בחירה עבור סמנים פני תא מסוימים יכולה לייצר אוכלוסיות תאים עם פעילות osteogenic משופרת 8, 9. בחירת ASCs עם פוטנציאל osteogenic הגבוה ביותר תגדיל את הסבירות כי פיגום זורע עם תאים אלה יכול להתחדש פגם עצם גדול.
חלבון עצם המוךפו"גנטי שהולך (BMP) איתות היא קריטית להסדרת עצם בידול היווצרות 10 ואת סוג קולטן BMP IB (BMPR-IB) ידוע להיות חשוב עבור osteogenesis ב ASCs 11. לאחרונה, הראינו ביטוי של BMPR-IB יכול בדואר המשמש כדי לבחור עבור ASCs עם פעילות osteogenic משופרת 12. כאן אנו מדגימים פרוטוקול לבידוד של BMPR-IB להביע ASCs משומן אדם ואחריו assay פעילות osteogenic שלהם באמצעות מודל פגם in vivo calvarial.
Protocol
Representative Results
Discussion
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
בזמן הקציר של ASCs, השלב הקריטי הוא אכול נאות של שומן עם collagenase. עיכול לקוי יגרום בתשואה נמוכה של ASCs. במהלך FACS מיון של תאי BMPR-IB +, חשוב להגדיר את השער בזהירות חיובית. הגדרת שערים מדי רופפת עלולה לגרום אוכלוסי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.D.M. was supported by the American College of Surgeons (ACS) Resident Research Scholarship. M.S.H. was supported by the California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Clinical Fellow training grant TG2-01159. M.S.H., H.P.L., and M.T.L. were supported by the American Society of Maxillofacial Surgeons (ASMS)/Maxillofacial Surgeons Foundation (MSF) Research Grant Award. H.P.L. was supported by NIH grant R01 GM087609 and a gift from Ingrid Lai and Bill Shu in honor of Anthony Shu. H.P.L. and M.T.L. were supported by the Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine and The Oak Foundation. M.T.L. was supported by NIH grants U01 HL099776, R01 DE021683-01, and RC2 DE020771. D.C.W. was supported by NIH grant 1K08DE024269, the Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, and the Stanford University Child Health Research Institute Faculty Scholar Award.
Materials
| 100 micron cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 15 blade scalpel | Miltex | 4-515 | |
| 24 well plate | Corning | 3524 | |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-0 Ethilon nylon suture, 18", P-3 needle, | Ethicon | 1698G | |
| Anti-BMPR-IB primary antibody | R&D systems | FAB5051A | |
| BioGel PI surgical gloves | Mölnlycke Health Care | ALA42675Z | |
| Buprenorphine SR | ZooPharm | ||
| Castro-Viejo needle driver | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| CD1 nude mouse | Charles River | 086 | |
| Collagenase Type II powder | Gibco | 17101-015 | |
| DMEM medium | Gibco | 10564-011 | |
| Drill: Circular knife 4.0 mm | Xemax Surgical | CK40 | |
| Drill: Z500 Brushless Micromotor | NSK | NSKZ500 | |
| FBS | Gicbo | 10437-077 | |
| Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24" | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4" | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-20 | |
| Hyclone 199/EBSS medium | GE Life Sciences | SH30253.01 | |
| Isothesia isoflurane | Henry Schein | 050033 | |
| Micro Forceps with teeth | Roboz | RS-5150 | |
| Micro Forceps with teeth | Roboz | RS-5150 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Bemis | PM996 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140-122 | |
| PLGA scaffolds | Proprietary Formulation | ||
| Poloxamer 188, 10% | Sigma | P5556-100ML | |
| Polylined Sterile Field, 18" x 24" | Busse Hospital Disposables | 696 | Cut a rectangular hole of the appropriate size |
| Polysucrose Solution: Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Medline | MDS093944H | |
| Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube | Dechra Veterinary Products | ||
| RBC lysis buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Webcol alcohol prep swabs | Covidien | 6818 |
References
- Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: an update. Injury. 36, S20-S27 (2005).
- Laurencin, C., Khan, Y., El-Amin, S. F. Bone graft substitutes. Expert Rev Med Devices. 3 (1), 49-57 (2006).
- Walmsley, G. G., et al. Nanotechnology in bone tissue engineering. Nanomedicine. 11 (5), 1253-1263 (2015).
- Chapekar, M. S. Tissue engineering: challenges and opportunities. J Biomed Mater Res. 53 (6), 617-620 (2000).
- Levi, B., et al. Human adipose derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defects. PLoS One. 5 (6), e11177 (2010).
- Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100 (9), 1249-1260 (2007).
- Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. J Biol Chem. 286 (45), 39497-39509 (2011).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1)-positive selection enhances osteogenic capacity of human adipose-derived stromal cells. Tissue Eng Part A. 19 (7-8), 989-997 (2013).
- Wozney, J. M., et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science. 242 (4885), 1528-1534 (1988).
- Wan, D. C., et al. Osteogenic differentiation of mouse adipose-derived adult stromal cells requires retinoic acid and bone morphogenetic protein receptor type IB signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (33), 12335-12340 (2006).
- McArdle, A., et al. Positive selection for bone morphogenetic protein receptor type-IB promotes differentiation and specification of human adipose-derived stromal cells toward an osteogenic lineage. Tissue Eng Part A. 20 (21-22), 3031-3040 (2014).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (71), e4425 (2013).
- Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. J Vis Exp. (68), (2012).
- Lester, S. C. . Manual of surgical pathology. , (2010).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
