Summary

Isolement rapide de BMPR-IB + Adipose-Derived cellules stromales pour utilisation dans un calvarial Defect Modèle de guérison

Published: February 24, 2017
doi:

Summary

Adipose-derived stromal cells may be useful for engineering new tissue from a patient’s own cells. We present a protocol for the isolation of a subpopulation of human adipose-derived stromal cells (ASCs) with increased osteogenic potential, followed by application of the cells in an in vivo calvarial healing assay.

Abstract

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient’s own body. The ability to grow bone de novo using a patient’s own cells would allow bony defects to be filled with adequate tissue without the morbidity of harvesting native bone. There is interest in the use of adipose-derived stromal cells (ASCs) as a source for tissue engineering because these are obtained from an abundant source: the patient’s own adipose tissue. However, ASCs are a heterogeneous population and some subpopulations may be more effective in this application than others. Isolation of the most osteogenic population of ASCs could improve the efficiency and effectiveness of a bone engineering process. In this protocol, ASCs are obtained from subcutaneous fat tissue from a human donor. The subpopulation of ASCs expressing the marker BMPR-IB is isolated using FACS. These cells are then applied to an in vivo calvarial defect healing assay and are found to have improved osteogenic regenerative potential compared with unsorted cells.

Introduction

défauts osseux majeurs résultant d'une lésion, une infection ou un cancer invasif ont un impact significatif sur la récupération et la qualité de vie d'un patient. Il existe des techniques pour combler ces défauts avec l' os sain d'ailleurs dans son propre corps du patient, mais ce transfert porte sa propre morbidité et risque de complications 1, 2, 3. En outre, certains défauts sont si importantes ou complexes que l'os donneur suffisante ne sont pas disponibles pour combler le défaut. Dispositifs prothétiques sont une option potentielle pour le remplissage de défauts osseux , mais ceux – ci sont associés à plusieurs inconvénients , notamment le risque d'infection, panne matérielle, et la réaction de corps étranger 4.

Pour ces raisons , il y a un grand intérêt dans la possibilité de l' ingénierie des substituts osseux biologiques en utilisant les propres cellules d'un patient 5. cellules stromales adipeuses (CSA)ont le potentiel pour cette application , car ils sont disponibles en abondance dans le propre tissu adipeux du patient et ils ont démontré la capacité de guérir les défauts osseux en générant un nouveau tissu osseux 6, 7. ASCs sont une population hétérogène de cellules , et plusieurs études ont montré que la sélection de marqueurs spécifiques de la surface cellulaire peut produire des populations de cellules ayant une activité améliorée ostéogénique 8, 9. La sélection ASCs avec le potentiel le plus élevé ostéogénique augmenterait la probabilité qu'un échafaudage tête de série avec ces cellules peut régénérer un grand défaut osseux.

Une protéine morphogénétique osseuse (BMP) de signalisation est essentielle pour la régulation de la différenciation osseuse et la formation 10 et le type de récepteur de BMP IB (BMPR-IB) est connu pour être important pour l' ostéogenèse dans ASCs 11. Récemment, nous avons montré que l'expression de BMPR-IB peut be utilisée pour sélectionner ASCs avec une activité accrue ostéogénique 12. Ici , nous démontrons un protocole pour l'isolement de l' ASC de la graisse humaine , suivie par un test de leur activité ostéogénique in vivo en utilisant un modèle calvarial de défaut BMPR-IB-exprimant.

Protocol

NOTE: Les échantillons ont été obtenus à partir de patients qui ont donné leur consentement éclairé. Tous les protocoles ont été examinés et approuvés par le comité d'examen institutionnel de l'Université de Stanford approprié. Lors de la manipulation des tissus et cellules humains, toujours adhérer à biosécurité de niveau 2 (NSB2) précautions, tel que spécifié par votre institution. 1. Préparation des réactifs Préparer un tampon FACS: Ajouter 10 ml…

Representative Results

Micro CT scan effectué le jour de la chirurgie montrera clairement le défaut du crâne. A cette époque, il n'y aura pas d'interposition dans le défaut de 4 mm. On obtient des analyses ultérieures au cours du temps afin de quantifier la taille du défaut au fil du temps par rapport à la ligne de base. Défauts ensemencés avec BMPR-IB cellules + devraient démontrer plus fermeture rapide du défaut par rapport à BMPR-IB- et les cellules non triées (figure 5).</stro…

Discussion

Étapes critiques dans le Protocole

Lors de la récolte de ASCs, l'étape critique est la digestion adéquate de graisse avec de la collagénase. digestion inadéquate se traduira par un faible rendement de ASCs. Au cours de tri FACS de cellules BMPR-IB +, il est important de définir soigneusement la porte de positivité. Définition de portes trop lâche peut entraîner des populations triées qui ne sont pas pures. Lors de la création du défaut crânienne, il est essentiel pour percer …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

C.D.M. was supported by the American College of Surgeons (ACS) Resident Research Scholarship. M.S.H. was supported by the California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Clinical Fellow training grant TG2-01159. M.S.H., H.P.L., and M.T.L. were supported by the American Society of Maxillofacial Surgeons (ASMS)/Maxillofacial Surgeons Foundation (MSF) Research Grant Award. H.P.L. was supported by NIH grant R01 GM087609 and a gift from Ingrid Lai and Bill Shu in honor of Anthony Shu. H.P.L. and M.T.L. were supported by the Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine and The Oak Foundation. M.T.L. was supported by NIH grants U01 HL099776, R01 DE021683-01, and RC2 DE020771. D.C.W. was supported by NIH grant 1K08DE024269, the Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, and the Stanford University Child Health Research Institute Faculty Scholar Award.

Materials

100 micron cell strainer Falcon 352360
15 blade scalpel Miltex 4-515
24 well plate Corning 3524
40 micron cell strainer Falcon 352340
50 mL conical centrifuge tubes Falcon 352098
6-0 Ethilon nylon suture, 18", P-3 needle,  Ethicon 1698G
Anti-BMPR-IB primary antibody R&D systems FAB5051A
BioGel PI surgical gloves Mölnlycke Health Care ALA42675Z
Buprenorphine SR ZooPharm
Castro-Viejo needle driver Fine Science Tools 12565-14
CD1 nude mouse Charles River 086
Collagenase Type II powder Gibco 17101-015
DMEM medium Gibco 10564-011
Drill: Circular knife 4.0 mm Xemax Surgical CK40
Drill: Z500 Brushless Micromotor NSK NSKZ500
FBS Gicbo 10437-077
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24" Fisher Scientific 14-206-62
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4" Fisher Scientific 22-415-469
Heating pad Kent Scientific DCT-20
Hyclone 199/EBSS medium GE  Life Sciences SH30253.01
Isothesia isoflurane Henry Schein  050033
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Paraffin film (Parafilm) Bemis PM996
PBS Gibco 10010-023
Pen-Strep Gibco 15140-122
PLGA scaffolds Proprietary Formulation
Poloxamer 188, 10% Sigma P5556-100ML
Polylined Sterile Field, 18" x 24" Busse Hospital Disposables 696 Cut a rectangular hole of the appropriate size
Polysucrose Solution: Histopaque 1119 Sigma 11191
Povidone Iodine Prep Solution Medline MDS093944H
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube Dechra Veterinary Products
RBC lysis buffer Sigma 11814389001
Webcol alcohol prep swabs Covidien 6818

References

  1. Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
  2. Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: an update. Injury. 36, S20-S27 (2005).
  3. Laurencin, C., Khan, Y., El-Amin, S. F. Bone graft substitutes. Expert Rev Med Devices. 3 (1), 49-57 (2006).
  4. Walmsley, G. G., et al. Nanotechnology in bone tissue engineering. Nanomedicine. 11 (5), 1253-1263 (2015).
  5. Chapekar, M. S. Tissue engineering: challenges and opportunities. J Biomed Mater Res. 53 (6), 617-620 (2000).
  6. Levi, B., et al. Human adipose derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defects. PLoS One. 5 (6), e11177 (2010).
  7. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100 (9), 1249-1260 (2007).
  8. Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. J Biol Chem. 286 (45), 39497-39509 (2011).
  9. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1)-positive selection enhances osteogenic capacity of human adipose-derived stromal cells. Tissue Eng Part A. 19 (7-8), 989-997 (2013).
  10. Wozney, J. M., et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science. 242 (4885), 1528-1534 (1988).
  11. Wan, D. C., et al. Osteogenic differentiation of mouse adipose-derived adult stromal cells requires retinoic acid and bone morphogenetic protein receptor type IB signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (33), 12335-12340 (2006).
  12. McArdle, A., et al. Positive selection for bone morphogenetic protein receptor type-IB promotes differentiation and specification of human adipose-derived stromal cells toward an osteogenic lineage. Tissue Eng Part A. 20 (21-22), 3031-3040 (2014).
  13. Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (71), e4425 (2013).
  14. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. J Vis Exp. (68), (2012).
  15. Lester, S. C. . Manual of surgical pathology. , (2010).
  16. Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).

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Cite This Article
Marshall, C. D., Zielins, E. R., Brett, E. A., Blackshear, C. P., Hu, M. S., Leavitt, T., Barnes, L. A., Lorenz, H. P., Longaker, M. T., Wan, D. C. Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model. J. Vis. Exp. (120), e55120, doi:10.3791/55120 (2017).

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