Nous avons établi un procédé pour la purification des protéines d'interaction co-régulation utilisant le système LC-MS / MS.
Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.
interactions protéine-protéine jouent un rôle important dans de nombreuses fonctions biologiques. Par conséquent, ces interactions ont été impliquées dans la transduction du signal; le transport de protéines à travers les membranes cellulaires; le métabolisme cellulaire; et plusieurs processus nucléaires, y compris la replication de l' ADN, la réparation des dommages de l' ADN, la recombinaison et la transcription 1, 2, 3, 4. L'identification des protéines impliquées dans ces interactions est par conséquent essentiel de faire progresser notre compréhension de ces processus cellulaires.
Immunoprécipitation (IP) est une technique utilisée pour valider l'analyse des interactions protéine-protéine. Afin de faciliter l'identification des protéines co-immunoprécipitation, la spectrométrie de masse est souvent utilisée 5, 6, 7, 8,9. En ciblant un élément connu d'un complexe protéique avec un anticorps, il est possible d'isoler le complexe de protéines et d'identifier ensuite les composants inconnus par analyse par spectrométrie de masse. ARIP4 (protéine androgène-récepteur coopérant 4), un co – régulateur de la transcription, interagit avec les protéines de récepteurs nucléaires, afin d'activer ou de réprimer les promoteurs cibles d'une manière dépendante du contexte 9, 10. Pour mieux comprendre les mécanismes de régulation de transcription qui régissent ces facteurs nucléaires, nous décrivons une méthode complète pour purifier et identifier les protéines qui interagissent ARIP4 en utilisant le système LC-MS / MS.
transfection efficace est essentielle pour obtenir un bon résultat avec ce protocole. En conséquence, nous vous recommandons d'utiliser l'analyse Western blot pour déterminer les niveaux de protéine FLAG-tagged immunoprécipitées. Cette étape permet aux utilisateurs de vérifier que leur protéine d'intérêt est correctement surexprimée et, en outre, que l'adresse IP a été réalisée avec succès. les niveaux de protéine étiquetée FLAG doivent également être vérifiés avant l'analyse …
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by the Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders (HT), the Takeda Science Foundation (HT), and by a Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Young Scientists (B) to HT.
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x) | nacalai tesque | 03969-21 | |
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
Micro Bio-Spin Columns | BIO-RAD | 732-6204 |