שיטה למדידת מטבוליזם ב ממוינות תת-אוכלוסיות של קהילות Cell מורכבות באמצעות איתור איזוטופ יציב
Summary
This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.
Abstract
Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of “mock sorted” cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.
Introduction
יצורים עילאיים להכיל קהילות שלמות מורכבות של סוגי תא ברורים כי לשתף פעולה כדי להביא פונקציות מורכבות יותר. לדוגמא, גידולים לכלול לא רק תאים סרטניים, אלא גם פיברובלסטים, תאים המהווים כלי דם, ולעתים קרובות תא חיסון מחלחל 1; דם מכיל תערובת מורכבת של עשרות תת תא חיסון 2; ואפילו שורות תאים בתרבית עשויות להיות מורכבות תת-אוכלוסיות מרובות, כגון לומינל, תת בסיס של תאי סרטן השד 3. יתר על כן, סוגי תא ברורים כי לדור בכפיפה אחת יכול להפגין מטבולית "שיתוף פעולה". לדוגמה, במוח, האסטרוציטים הם חשבו להמיר גלוקוז לקטט, אשר אז "הפד" לנוירונים כי לחמצן מצע זה 4; לימפוציטים מסוג T הם בהקשרים מסוימים תלויים תאים דנדריטים סמוכים כמקור ציסטאין 5; ותאים סרטניים יכולים לשתף פעולה עם Assoפיברובלסטים ciated בגידולים 6. כדי להבין את ההתנהגות המטבולית של מערכות כאלה, חשוב להפריד ולמדוד את הפעילות המטבולית של תאים מסוגים שונים בהווה.
ללא ספק השיטה הנפוצה ביותר להפרדת סוגי תאים היא מיון תא מופעל קרינה. שיטה זו היא החלימה רחב, ובלבד סוג התא או המדינה של עניין ניתן "שכותרתו" באמצעות נוגדני ניאון, ביטוי של חלבוני ניאון מהונדסים, או צבעים אחרים. אפשרות אחת היא סוגי תאים נפרדים בתחילה באמצעות סדרן תא, מחדש תרבות סוגי התאים הבודדים מתקבלים, ולאחר מכן לבצע מחקרים מטבוליזם של תרבויות אלה 7. עם זאת, זה אינו ריאלי רק אם הסוג או פנוטיפ התא יציב בתנאי תרבות, ולא יכול ללכוד התנהגות חולפת כמו מצבי מחזור התא, ולא את שיתוף הפעולה המטבולית שיתוף תרבויות. במקרים כאלה, מטבוליזם חייב להימדד ישירות על כךתאי rted. זה מאתגר מאז מיון תא הליך נושאים לתאים מדגיש כי עלול לעוות את חילוף החומרים שלהם 8, ואנו מודעים רק מעט מחקרי נקיטת גישה זו 9, 10. בפרט, מצאנו כי מטבוליטים גדולים כמו חומצות אמינו עלולים לדלוף מתאים שמרה במאגר מיון תא, כך שמדידות של שפע המטבוליט מוחלט הם כבר לא אמינות 11 (אם כי השוואה יחסית בין שברי מיון עדיין עשויה להיות בעלי ערך).
כדי לעקוף בעיות אלה, אנו תווית תאים עם איזוטופים יציבים לפני מיון, ולהתמקד MIDs מטבוליטים הסלולר, ולא שכיחותם המטבוליט. מאז MIDs נוצרות על סולמות זמן רב יותר, הם צריכים להיות מושפעים פחות על ידי חשיפה קצרת טווח לתנאים מיון. אנחנו לכמת MIDs באמצעות ספקטרומטריית מסה מלאה ברזולוציה גבוהה סריקה, שהוא רגיש מספיק כדי לספק data על מאה מטבוליטים החלו מתאי סביב 500,000 מסודרים, המחייב כ 30-60 דקות של זמן על מיון תא. השוואה בין "מדומה מסודרת" שליטה (תאים עברו מכשיר סדרן תא ללא gating כל אוכלוסייה ספציפית) והפקת המטבוליט ישירות מצלחת התרבות הוא עשתה כדי להבטיח כי MIDs הנצפה הם שמייצגים את התרבות המקורית. בהתאם הבחירה של קליעים נותבים איזוטופ יציב, מסלולים מטבוליים שונים ניתן ללמוד עם שיטה זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה שלנו מבוססת על העיקרון כי MIDs מטבוליטים הסלולר לשקף את "ההיסטוריה" של פעילות מטבולית של התא. זה מאפשר לחקור פעילויות מטבוליים תת-אוכלוסייה של תאים, בעת התרחשותם בקהילה הסבוכה של תאים, לפני הליך מיון התא. לעומת זאת, באזורי שיא של מטבוליטים שונים באופן ניכר בי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Anas Kamleh for valuable help with optimizing mass spectrometry methods, and Annika von Vollenhoven for assistance with cell sorting. This research was supported by the Swedish Foundation for Strategic Research (grant no. FFL12-0220) and the Strategic Programme in Cancer Research (IR, RN); the Swedish Heart-Lung Foundation (CEW, HG); and Mary Kay Foundation (JW, MJ).
Materials
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree – MC – VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20×2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| MYRSYRA 99.5% OPTIMA (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5ml, 8-425 32×11.6mm,amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 LOCK SKRUV VITT PTFE PACKNING 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
References
- Gregersen, P. K. Cell type-specific eQTLs in the human immune system. Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).
- Heppner, G. H. Tumor heterogeneity. Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).
- Prat, A., et al. Characterization of cell lines derived from breast cancers and normal mammary tissues for the study of the intrinsic molecular subtypes. Breast Cancer Res. Treat. 142 (2), 237-255 (2013).
- Magistretti, P. J., Allaman, I. A Cellular Perspective on Brain Energy Metabolism and Functional Imaging. Neuron. 86 (4), 883-901 (2015).
- Angelini, G., et al. Antigen-presenting dendritic cells provide the reducing extracellular microenvironment required for T lymphocyte activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1491-1496 (2002).
- Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Harris, A. L., Sivridis, E. Comparison of metabolic pathways between cancer cells and stromal cells in colorectal carcinomas: A metabolic survival role for tumor-associated stroma. Cancer Res. 66 (2), 632-637 (2006).
- Hollenbaugh, J. A., Munger, J., Kim, B. Metabolite profiles of human immunodeficiency virus infected CD4+ T cells and macrophages using LC-MS/MS analysis. Virology. 415 (2), 153-159 (2011).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytom. Part A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Moussaieff, A., et al. High-resolution metabolic mapping of cell types in plant roots. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (13), E1232-E1241 (2013).
- Johnson, C., et al. A metabolic signature of colon cancer initiating cells. Cancer Metab. 2, 32 (2014).
- Roci, I., et al. Metabolite Profiling and Stable Isotope Tracing in Sorted Subpopulations of Mammalian Cells. Anal. Chem. 88 (5), 2707-2713 (2016).
- Shapiro, H. . Practical flow cytometry. , (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Noack, S., Wiechert, W. Quantitative metabolomics: A phantom. Trends Biotechnol. 32 (5), 238-244 (2014).
