Une méthode pour mesurer le métabolisme dans des communautés triées sous-populations cellulaires complexes Utilisation Stable Isotope Tracing

les organismes supérieurs contiennent des communautés complexes de types cellulaires distincts qui collaborent pour réaliser des fonctions plus complexes. Par exemple, les tumeurs contiennent non seulement les cellules cancéreuses, mais aussi des fibroblastes, des cellules qui constituent les vaisseaux sanguins et de cellules immunitaires souvent infiltrats ^1; sang contient un mélange complexe de plusieurs dizaines de sous – types de cellules immunitaires ^2; et même des lignées cellulaires cultivées peuvent être constituées de plusieurs sous – populations, comme l'luminale et les sous – types de base de cellules de cancer du sein ^3. De plus, les types de cellules distinctes qui coexistent peut présenter métabolique "collaboration". Par exemple, dans le cerveau, les astrocytes sont pensés pour convertir le glucose en lactate qui est ensuite «alimenté» pour les neurones qui oxydent ce substrat ^4; Les lymphocytes T sont dans certains contextes , qui dépendent des cellules dendritiques adjacentes en tant que source de cystéine ^5; et les cellules cancéreuses peuvent collaborer avec des assofibroblastes ciés dans les tumeurs ^6. Pour comprendre le comportement métabolique de tels systèmes, il est nécessaire de séparer et de mesurer les activités métaboliques des différents types présents de cellules.

De loin, la méthode la plus largement utilisée pour séparer les types de cellules est le tri cellulaire activé par fluorescence. Ce procédé est largement applicable, à condition que le type de cellule ou d'un état d'intérêt peuvent être "marqués" en utilisant des anticorps fluorescents, l'expression de protéines fluorescentes modifiées, ou d'autres colorants. Une option est de types de cellules initialement séparées par un trieur de cellules, re-culture les types cellulaires individuels obtenus, puis effectuer des études sur le métabolisme de ces cultures ^7. Toutefois, cela est seulement possible si le type de cellule ou d'un phénotype est stable dans des conditions de culture, et ne peuvent pas capturer le comportement transitoire tels que les états du cycle cellulaire, ni la coopération métabolique dans les co-cultures. Pour de tels cas, le métabolisme doit être mesurée directement sur tantcellules rted. Cela est difficile car la cellule procédure de tri soumet les cellules à des contraintes qui peuvent fausser leur métabolisme ^8, et nous sommes conscients de seulement quelques études qui suivent cette approche ^{9, 10.} En particulier, nous avons constaté que les principaux métabolites tels que les acides aminés peuvent fuir à partir de cellules conservées dans un tampon de tri cellulaire, de sorte que les mesures de l' abondance absolue des métabolites ne sont plus fiables ¹¹ (bien que la comparaison relative entre fractions triées peut encore être utile).

Pour contourner ces problèmes, nous appelons les cellules avec des isotopes stables avant le tri, et de se concentrer sur les MIDs en métabolites cellulaires, plutôt que les abondances métabolites. Depuis MIDs sont formés sur des échelles de temps plus longues, ils devraient être moins affectés par l'exposition à court terme à des conditions de tri. Nous quantifions MIDs utilisant-balayage complet à haute résolution spectrométrie de masse, ce qui est assez sensible pour fournir data sur des centaines de métabolites à partir de environ 500.000 cellules triées, nécessitant environ 30-60 min de la cellule de temps à trier. Une comparaison entre un "mock triée" contrôle (cellules transmises à travers l'instrument de trieur de cellules sans gating une population spécifique) et l'extraction des métabolites directement à partir de la boîte de culture est faite pour veiller à ce que les MIDs observés sont représentatifs de ceux de la culture d'origine. En fonction du choix des traceurs isotopiques stables, diverses voies métaboliques peuvent être étudiés par cette méthode.