En Vivo Investigación de Terapia de luz azul antimicrobianos para multirresistente Acinetobacter baumannii infecciones de quemaduras El uso de bioluminiscencia Imaging
Summary
Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.
Abstract
Queman las infecciones continúan siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad. La creciente aparición de bacterias resistentes a múltiples fármacos (MDR) ha conducido al fracaso frecuente de los tratamientos tradicionales con antibióticos. Se necesitan urgentemente terapias alternativas para hacer frente a las bacterias resistentes a múltiples fármacos.
Un enfoque no antibiótico innovador, antimicrobiano luz azul (ABL), ha demostrado eficacia prometedora contra las infecciones resistentes a múltiples fármacos. El mecanismo de acción de ABL no está todavía bien entendido. Se plantea la hipótesis comúnmente que ocurre naturalmente cromóforos fotosensibilizadores endógenos en bacterias (por ejemplo, porfirinas libres de hierro, flavinas, etc.) son excitados por Abl, que a su vez produce citotóxicos especies reactivas de oxígeno (ROS) a través de un proceso fotoquímico.
A diferencia de otro enfoque antimicrobiana basada en la luz, la terapia fotodinámica antimicrobiana (TFDa), terapia de ABL no requiere la participación de un photosensitiz exógenoer. Todo lo que necesita para tener efecto es la irradiación de luz azul; Por lo tanto, es simple y barato. Los receptores ABL son los fotosensibilizadores celulares endógenos en bacterias, en lugar del ADN. Por lo tanto, Abl se cree que es mucho menos genotóxico a las células huésped que la irradiación ultravioleta C (UVC), lo que provoca daños en el ADN directamente en las células huésped.
En este trabajo, se presenta un protocolo para evaluar la eficacia de la terapia de ABL para MDR Acinetobacter baumannii infecciones en un modelo de ratón de lesión por quemadura. Mediante el uso de una cepa bioluminiscente ingeniería, hemos sido capaces de controlar de forma no invasiva el grado de infección en tiempo real en animales vivos. Esta técnica es también una herramienta efectiva para el control de la distribución espacial de las infecciones en animales.
Introduction
Infecciones quemar, que se presentan con frecuencia debido a las lesiones cutáneas térmicas, siguen siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad 1. El tratamiento de las infecciones de quemaduras ha sido comprometida aún más por la creciente aparición de (MDR) cepas bacterianas resistentes a múltiples fármacos 2 debido a la utilización masiva de antibióticos. Una bacteria Gram-negativas MDR importantes es Acinetobacter baumannii, que es conocido por estar asociado con heridas de guerra recientes y es resistente a casi todos los antibióticos disponibles 3. La presencia de biofilms en los focos lesionada ha informado 4, 5 y se cree que agravar la tolerancia a los antibióticos y la defensa del huésped 6, 7, causando infecciones persistentes 8, 9. Por lo tanto, existe la vasopresinag necesita para el desarrollo de tratamientos alternativos. En la Estrategia Nacional de Lucha contra la recientemente anunciada bacterias resistentes a antibióticos, el desarrollo de terapias alternativas a los antibióticos ha sido señalado como una acción por parte del gobierno de los Estados Unidos 10.
enfoques antimicrobianos basados en la luz, como se indica por el nombre, requieren irradiación de luz con o sin otros agentes. Estos enfoques incluyen la terapia antimicrobiana fotodinámica (TFDa), ultravioleta C (UVC) la irradiación, y la luz azul antimicrobiano (ABL). En estudios anteriores, que han demostrado eficacia prometedora en matar cepas bacterianas resistentes a múltiples fármacos 11, 12, 13. Entre los tres enfoques basados en la luz, abl ha atraído una atención creciente en los últimos años debido a sus propiedades antibacterianas intrínsecas sin el uso de fotosensibilizadores 14. en comparIson a TFDa, Abl sólo implica el uso de la luz, mientras que TFDa requiere una combinación de luz y un fotosensibilizador. Por lo tanto, ABL es simple y barato 14. En comparación con UVC, Abl se cree que es mucho menos citotóxico y genotóxico a las células huésped 15.
El objetivo de este protocolo es investigar la eficacia de ABL para el tratamiento de infecciones de quemaduras causadas por A. baumannii multirresistente en un modelo de ratón. Utilizamos bacterias patógenas bioluminiscentes para desarrollar nuevos modelos de ratón de las infecciones de quemaduras que permiten la monitorización no invasiva de la carga bacteriana en tiempo real. En comparación con el método tradicional de toma de muestras de fluidos corporales / tejidos y la posterior siembra y recuento de colonias 16, esta técnica proporciona resultados precisos. El proceso de muestreo de tejido podría introducir otra fuente de error experimental. Puesto que la intensidad de la luminiscencia bacteriana es linealmente proporcional a la corresponding bacteriana CFU 17, podemos medir directamente la supervivencia de las bacterias después de una cierta dosis de irradiación de luz. Mediante la supervisión de la carga bacteriana en animales vivos recibir el tratamiento con luz en tiempo real, la cinética de la destrucción bacteriana se pueden caracterizar utilizando un número significativamente reducido de ratones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abl es un nuevo método para el tratamiento de infecciones. Desde su mecanismo de acción es completamente diferente a la de la quimioterapia, es más de un fisioterapia. El agente que media el efecto antimicrobiano es la irradiación con luz azul (400-470 nm). Con el desarrollo de los LEDs azules, ganamos acceso a un enfoque basado en la luz antimicrobiano eficaz y sencilla para las infecciones resistentes a múltiples fármacos.
En este protocolo, hemos descrito el desarrollo de un modelo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Center for Integration of Medicine and Innovative Technology (CIMIT) under the U.S. Army Medical Research Acquisition Activity Cooperative Agreement (CIMIT No. 14-1894 to TD) and the National Institutes of Health (1R21AI109172 to TD). YW was supported by an ASLMS Student Research Grant (BS.S02.15). We are grateful to Tayyaba Hasan, PhD at the Wellman Center for her co-mentorship for YW.
Materials
| IVIS | PerkinElmer Inc, Waltham, MA | IVIS Lumina Series III | Pre-clinical in vivo imaging |
| Light-emitting diode LED | VieLight Inc, Toronto, Canada | 415 nm | Light source for illumination |
| Power/energy meter | Thorlabs, Inc., Newton, NJ | PM100D | Light irradiance detector |
| Mouse | Charles River Laboratories, Wilmington, MA | BALB/c | 7-8 weeks age, 17-19 g weight |
| Acinetobacter baumannii | Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX | Clinical isolate | Engineered luminescent strain |
| Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 721016 | 0.9% Sodium Chloride |
| Phosphate Buffered Saline, 1X Solution | Fisher Scientific | BP24384 | A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures |
| Brain Heart Infusion | Fisher Scientific | B11059 | Bacterial culture medium |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | For bacterial suspension centrifuge |
| Benchtop Incubated Orbital Shakers | Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH | Incu-Shaker Mini | For culturing of bacteria |
| Inoculating Loops | Fisher Scientific | 22-363-605 | For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice |
| Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200µL | Fisher Scientific | 02-707-502 | Pipet Tips |
| Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-220 | For bacterial suspension seperation |
| Brass Block | Small Parts, Inc., Miami, FL | 10 mm by 10 mm | For creation of burns in mice |
| Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves | Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY | PBI83514 | Heat Resistant Gloves |
| Greiner dishes | Sigma-Aldrich Co. LLC | P5112-740EA | 35 mm ×10 mm |
| Corning Digital Hot Plate | Cole-Parmer Instrument Company, LLC | UX-84301-65 | 10" x 10", 220 VAC, for boiling water |
| Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed | E-Z Systems | EZ-211 | Prevents heat loss and hypothermia during surgery |
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