Summary

In vivo Investigation of Antimicrobial Therapy Blue Light pour multirésistante Acinetobacter baumannii Gravez Infections En utilisant l' imagerie par bioluminescence

Published: April 28, 2017
doi:

Summary

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

Abstract

Brûler les infections continuent d'être une cause importante de morbidité et de mortalité. L'émergence croissante des bactéries multirésistantes (MDR) a conduit à l'échec fréquent des traitements antibiotiques traditionnels. D'autres sont thérapeutiques d'urgence nécessaires pour lutter contre les bactéries MDR.

Une approche innovante non-antibiotique, bleu clair antimicrobien (ABL), a montré l'efficacité prometteuse contre les infections MDR. Le mécanisme d'action de ABL est pas encore bien compris. Il est généralement supposé que sont excités par ABL, qui à son tour se produisant naturellement chromophores photosensibilisants endogènes dans des bactéries (par exemple, les porphyrines libres de fer, les flavines, etc.) produit des espèces oxygénées réactives cytotoxiques (ROS) par l' intermédiaire d' un processus photochimique.

Contrairement à une autre approche antimicrobienne à base de lumière, la thérapie photodynamique antimicrobien (aPDT), la thérapie ABL ne nécessite pas l'intervention d'un photosensitiz exogèneer. Tout ce qu'il a besoin de prendre effet est l'irradiation de la lumière bleue; , Il est donc simple et peu coûteuse. Les récepteurs ABL sont les photosensibilisants endogènes cellulaires chez les bactéries, plutôt que de l'ADN. Ainsi, Abl est considérée comme beaucoup moins génotoxique à des cellules hôtes que ultraviolets C (UVC) irradiation, ce qui provoque directement des dommages de l'ADN dans des cellules hôtes.

Dans cet article, nous présentons un protocole pour évaluer l'efficacité du traitement ABL pour MDR Acinetobacter baumannii infections dans un modèle de souris de brûlure. En utilisant une souche bioluminescente d'ingénierie, nous avons pu surveiller de manière non invasive l'étendue de l'infection en temps réel chez les animaux vivants. Cette technique est également un outil efficace pour la surveillance de la distribution spatiale des infections chez les animaux.

Introduction

Brûler les infections, qui sont fréquemment signalées en raison de blessures thermiques cutanées, continuent d'être une cause importante de morbidité et de mortalité 1. La prise en charge des infections de brûlures a été compromise par l'autre émergence croissante de souches bactériennes résistantes (MDR) 2 en raison de l'utilisation massive d'antibiotiques. Important MDR bactéries Gram-négatives est Acinetobacter baumannii, qui est connu pour être associé à des blessures de combat récentes et résiste à presque tous les antibiotiques disponibles 3. La présence de biofilms dans les foyers blessé a été rapporté 4, 5 et on pense à exacerber la tolérance aux antibiotiques et à la défense de l' hôte 6, 7, ce qui provoque des infections persistantes 8, 9. Par conséquent, il y a un outig besoin pour le développement de traitements alternatifs. Dans la Stratégie nationale de lutte contre les bactéries résistantes aux antibiotiques, le développement de thérapies alternatives aux antibiotiques récemment annoncé a été noté comme une action par le gouvernement des États-Unis 10.

approches antimicrobiens à base de lumière, comme il est indiqué par le nom, nécessitent une irradiation lumineuse avec ou sans autres agents. Ces approches comprennent la thérapie photodynamique antimicrobienne (aPDT), aux ultraviolets C (UVC) irradiation, et la lumière bleue antimicrobien (ABL). Dans des études antérieures, ils ont montré l' efficacité prometteuse pour tuer des souches MDR bactériennes 11, 12, 13. Parmi les trois approches à base de lumière, ABL a attiré une attention croissante au cours des dernières années en raison de ses propriétés antibactériennes intrinsèques sans l'utilisation de photosensibilisants 14. en comparison à aPDT, ABL implique que l'utilisation de la lumière, alors que aPDT nécessite une combinaison de lumière et un photosensibilisant. Par conséquent, ABL est 14 simple et peu coûteux. Par rapport à UVC, ABL semble être beaucoup moins cytotoxique et génotoxique pour les cellules hôtes 15.

L'objectif de ce protocole est d'étudier l'efficacité de ABL pour le traitement des infections causées par des brûlures MDR A. baumannii dans un modèle de souris. Nous utilisons des bactéries pathogènes bioluminescentes pour développer de nouveaux modèles de souris d'infections de brûlures qui permettent la surveillance non invasive de la charge bactérienne en temps réel. Par rapport à la méthode traditionnelle de prélèvement de fluide corporel / tissulaire et le placage subséquent et une colonie de comptage 16, cette technique fournit des résultats précis. Le processus de prélèvement de tissu pourrait introduire une autre source de l'erreur expérimentale. Comme l'intensité de luminescence bactérienne est linéairement proportionnelle aux corresponding CFU 17 bactérienne, on peut mesurer directement la survie des bactéries après une certaine dose d'irradiation de lumière. En surveillant la charge bactérienne chez les animaux vivants recevant le traitement par la lumière en temps réel, la cinétique de la destruction des bactéries peuvent être caractérisés par un nombre significativement réduit de souris.

Protocol

1. Préparation de la culture bactérienne Ajouter 7,5 ml de Brain Heart Infusion (BHI) moyenne à un tube de centrifugation de 50 ml. Graine A. baumannii cellules dans le milieu BHI et ensuite incuber la culture de A. baumannii dans un incubateur orbital (37 ° C) pendant 18 h. Centrifuger la culture de cellules à 3500 x g pendant 5 minutes, éliminer le surnageant et laver les pastilles dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Re-suspendre les pastilles …

Representative Results

La souche de A. baumannii que nous avons utilisé est un isolat clinique MDR, tel que rapporté précédemment 12, 17. La souche bactérienne a été faite bioluminescente par la transfection de l' opéra luxCDABE 11. La figure 1A montre les images de luminescence bactérienne successives à partir d' une souris infectée représentant brûlent avec 5 x 10 6<…

Discussion

Abl est un nouveau procédé pour traiter les infections. Depuis son mécanisme d'action est complètement différent de celui de la chimiothérapie, il est plus d'une physiothérapie. L'agent qui médie l'effet antimicrobien est l'irradiation de la lumière bleue (400-470 nm). Avec le développement de LED bleues, nous avons eu accès à une approche antimicrobienne à base de lumière simple et efficace pour les infections MDR.

Dans ce protocole, nous avons décrit le d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported in part by the Center for Integration of Medicine and Innovative Technology (CIMIT) under the U.S. Army Medical Research Acquisition Activity Cooperative Agreement (CIMIT No. 14-1894 to TD) and the National Institutes of Health (1R21AI109172 to TD). YW was supported by an ASLMS Student Research Grant (BS.S02.15). We are grateful to Tayyaba Hasan, PhD at the Wellman Center for her co-mentorship for YW.

Materials

IVIS  PerkinElmer Inc, Waltham, MA IVIS Lumina Series III Pre-clinical in vivo imaging
Light-emitting diode LED VieLight Inc, Toronto, Canada  415 nm Light source for illumination
Power/energy meter Thorlabs, Inc., Newton, NJ PM100D Light irradiance detector
Mouse  Charles River Laboratories, Wilmington, MA BALB/c 7-8 weeks age, 17-19 g weight
Acinetobacter baumannii  Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX Clinical isolate Engineered luminescent strain
Insulin Syringes Fisher Scientific 14-826-79 BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection
Sodium Chloride Fisher Scientific 721016 0.9% Sodium Chloride
Phosphate Buffered Saline, 1X Solution Fisher Scientific BP24384  A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures
Brain Heart Infusion Fisher Scientific B11059 Bacterial culture medium
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C For bacterial suspension centrifuge
Benchtop Incubated Orbital Shakers Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH  Incu-Shaker Mini For culturing of bacteria
Inoculating Loops Fisher Scientific 22-363-605   For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice
Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200µL Fisher Scientific 02-707-502 Pipet Tips
Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge Fisher Scientific 75-004-220 For bacterial suspension seperation
Brass Block Small Parts, Inc., Miami, FL 10 mm by 10 mm  For creation of burns in mice
Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY PBI83514  Heat Resistant Gloves
Greiner dishes Sigma-Aldrich Co. LLC P5112-740EA 35 mm ×10 mm
Corning Digital Hot Plate Cole-Parmer Instrument Company, LLC UX-84301-65 10" x 10", 220 VAC, for boiling water 
Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed E-Z Systems EZ-211 Prevents heat loss and hypothermia during surgery

References

  1. Gibran, N. S. Summary of the 2012 ABA Burn Quality Consensus conference. J Burn Care Res. 34 (4), 361-385 (2013).
  2. Sommer, R., Joachim, I., Wagner, S., Titz, A. New approaches to control infections: anti-biofilm strategies against gram-negative bacteria. Chimia (Aarau). 67 (4), 286-290 (2013).
  3. Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen. Clin Microbiol Rev. 21 (3), 538-582 (2008).
  4. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  5. Schaber, J. A. Pseudomonas aeruginosa forms biofilms in acute infection independent of cell-to-cell signaling. Infect Immun. 75 (8), 3715-3721 (2007).
  6. Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int J Antimicrob Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
  7. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiol Mol Biol Rev. 78 (3), 510-543 (2014).
  8. Akers, K. S. Biofilms and persistent wound infections in United States military trauma patients: a case-control analysis. BMC Infect Dis. 14, 190 (2014).
  9. Burmolle, M., et al. Biofilms in chronic infections – a matter of opportunity – monospecies biofilms in multispecies infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 59 (3), 324-336 (2010).
  10. . National strategy on combating antibiotic-resistant bacteria Available from: https://www.whitehouse.gov/sites/default/files/docs/carb_national_strategy.pdf (2014)
  11. Dai, T. Photodynamic therapy for Acinetobacter baumannii burn infections in mice. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3929-3934 (2009).
  12. Zhang, Y. Antimicrobial blue light therapy for multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infection in a mouse burn model: implications for prophylaxis and treatment of combat-related wound infections. J Infect Dis. 209 (12), 1963-1971 (2014).
  13. Dai, T., et al. Ultraviolet C light for Acinetobacter baumannii wound infections in mice: potential use for battlefield wound decontamination?. J Trauma Acute Care Surg. 73 (3), 661-667 (2012).
  14. Dai, T. Blue light for infectious diseases: Propionibacterium acnes, Helicobacter pylori, and beyond?. Drug Resist Updat. 15 (4), 223-236 (2012).
  15. Yin, R. Light based anti-infectives: ultraviolet C irradiation, photodynamic therapy, blue light, and beyond. Curr Opin Pharmacol. 13 (5), 731-762 (2013).
  16. Haisma, E. M. Inflammatory and antimicrobial responses to methicillin-resistant Staphylococcus aureus in an in vitro wound infection model. PLoS One. 8 (12), e82800 (2013).
  17. Wang, Y. Antimicrobial Blue Light Inactivation of Gram-Negative Pathogens in Biofilms: In Vitro and In Vivo Studies. J Infect Dis. 213 (9), 1380-1387 (2016).
  18. Chen, D., Shen, Y., Huang, Z., Li, B., Xie, S. Light-Emitting Diode-Based Illumination System for In Vitro Photodynamic Therapy. Int J Photoenergy. 2012 (2), (2012).
  19. Demidova, T. N., Gad, F., Zahra, T., Francis, K. P., Hamblin, M. R. Monitoring photodynamic therapy of localized infections by bioluminescence imaging of genetically engineered bacteria. J Photochem Photobiol B. 81 (1), 15-25 (2005).
  20. Hamblin, M. R., Zahra, T., Contag, C. H., McManus, A. T., Hasan, T. Optical monitoring and treatment of potentially lethal wound infections in vivo. J Infect Dis. 187 (11), 1717-1725 (2003).
  21. Rowan, M. P. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Critical Care. 19, 243 (2015).
  22. Marx, D. E., Barillo, D. J. Silver in medicine: The basic science. Burns. 40 (Supplement 1), S9-S18 (2014).
  23. Heyneman, A., Hoeksema, H., Vandekerckhove, D., Pirayesh, A., Monstrey, S. The role of silver sulphadiazine in the conservative treatment of partial thickness burn wounds: A systematic review. Burns. 42 (7), 1377-1386 (2016).
  24. Roberts, J. A. Individualised antibiotic dosing for patients who are critically ill: challenges and potential solutions. Lancet Infect Dis. 14 (6), 498-509 (2014).
  25. Dai, T. Blue light eliminates community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in infected mouse skin abrasions. Photomed Laser Surg. 31 (11), 531-538 (2013).
  26. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  27. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  28. Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2015).
  29. Song, H. H. Phototoxic effect of blue light on the planktonic and biofilm state of anaerobic periodontal pathogens. J Periodontal Implant Sci. 43 (2), 72-78 (2013).
  30. Rosa, L. P., da Silva, F. C., Viana, M. S., Meira, G. A. In vitro effectiveness of 455-nm blue LED to reduce the load of Staphylococcus aureus and Candida albicans biofilms in compact bone tissue. Lasers Med Sci. 31 (1), 27-32 (2015).
  31. Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm blue light. Photomed Laser Surg. 24 (6), 684-688 (2006).
  32. Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed Laser Surg. 27 (2), 221-226 (2009).
  33. Bumah, V. V., Masson-Meyers, D. S., Cashin, S. E., Enwemeka, C. S. Wavelength and bacterial density influence the bactericidal effect of blue light on methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Photomed Laser Surg. 31 (11), 547-553 (2013).
  34. Maclean, M., MacGregor, S. J., Anderson, J. G., Woolsey, G. Inactivation of bacterial pathogens following exposure to light from a 405-nanometer light-emitting diode array. Appl Environ Microbiol. 75 (7), 1932-1937 (2009).
  35. Kim, M. Optical lens-microneedle array for percutaneous light delivery. Biomedical Optics Express. 7 (1o), 4220-4227 (2016).

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Wang, Y., Harrington, O. D., Wang, Y., Murray, C. K., Hamblin, M. R., Dai, T. In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (122), e54997, doi:10.3791/54997 (2017).

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