マウス胚中足骨の文化：軟骨内骨化の生理学的モデル

スケルトンは、イオン恒常性に、歩行及ぶ機能の範囲を持っている非常に、複雑な動的で複雑な器官です。骨および軟骨からなる、骨格が、それは、構造的、生化学的および機械的完全性¹です維持するために動作する機能的に異なる細胞集団で構成されています。スケルトンの主な機能の1つは、発展と成長におけるその役割です。これらのプロセスは、タイトな内分泌および遺伝的制御を介して調節されている複数の細胞集団のオーケストレーションを必要とします。

平らな骨、例えば肩甲骨、頭蓋及び胸骨を除いて、哺乳動物の骨格が軟骨内骨化と呼ばれるプロセスを介して形成されています。規制の両方の分子的および空間的にこのプロセスは、中胚葉²から主に由来間葉系細胞の縮合から始まります。転写因子SOX9の影響下で、細胞を目で縮合の電子内部は発現していると、そのようなII型コラーゲンおよびアグリカンなどの軟骨特定の細胞外マトリックス（ECM）成分を分泌する、軟骨細胞に分化します。結露のマージンの細胞を、Iコラーゲンと将来の骨^3の輪郭^を描く、軟骨膜を形成急行タイプ。その後、軟骨膜の骨幹は、転写因子、Runx2のとオステリックス⁴の発現が監督、骨芽細胞に分化します。これは、骨芽細胞の優位性をもたらし、この層は、骨の中間部周りの鉱化骨の襟を形成骨膜という名前に変更されます。軟骨足場の骨膜および浸潤の血管の浸透は、それに軟骨細胞の残骸や軟骨基質⁵の多くを再吸収haematopoetically由来の骨吸収細胞、破骨細胞を、持参発生します。形成された空間は、一次骨化を生じさせる骨幹によって充填されています次第に骨幹の中核を占め、骨膜と合流センター。他の細胞は骨髄を生じさせます。出産の周囲には、血管および骨幹細胞は、二次骨化中心を形成するために開発骨幹のいずれかの側（骨端）で軟骨が豊富なマトリックスを貫通しています。骨端成長板- -すべての長骨⁶の線形成長を調整する責任を負う長骨の両端に骨端と骨幹の間に位置する軟骨のバンドです。

成長板内の軟骨細胞は、最初に増殖し、その後、転写および成長因子の連続式でコーディネート形態学的に異なるゾーンを経て進行します。この一連のイベントの集大成がこの軟骨前駆体の中心で軟骨細胞の細胞周期と肥大からの出口です。肥大軟骨細胞を強く速達X型コラーゲンおよびマトリックスメタロプロテアーゼ-13（MMP13）と縦成長の方向のかなりの量の拡大は、哺乳動物^7,8における骨の成長への最大の貢献を提供します。また、肥大軟骨細胞はマトリックス小胞の放出を介して、その周囲のECMの石灰化、膜構造は、それらのホスファターゼの包含（組織非特異的アルカリホスファターゼ（TNAP）とPHOSPHO1）を介して、非晶質リン酸カルシウムの製造に特化境界カルシウムタンパク質チャネリング（アネキシン^）9-11。この石灰化軟骨は、破骨細胞の動員およびマトリックス再吸収の結果、基礎となる骨髄から血管に侵略されています。これは、彼らが急速に鉱化ある類骨の層を敷設石灰化軟骨の残党の表面に骨芽細胞の遊走とアライメントが続いています。一次海綿の網状骨は、後に二次海綿質¹²の層板骨に改造されています。中骨端核融合の結果軟骨内骨化¹³の停止。

乱れ発生および/または長手方向の骨の成長^14を防止するために軟骨内骨化は、多くの内分泌および傍分泌ホルモンおよび成長因子による厳しい規制の下にあります。これらのプロセスを支える分子・細胞メカニズムのより良い理解は、人間の利益に向けて臨床の進歩の追求で、したがって必須です。異なる年齢、場所や種の成長板との間の類似点と相違点へのこれまでの研究では、大幅に成長板のダイナミクスを^15,16の周囲^の生理学的メカニズムの理解を改善しています。その環境からの軟骨細胞の除去は、COL2A1 ¹⁷などの主要なマーカーの発現の消失を伴う、脱分化につながることができますようにしかし、単離された軟骨細胞の研究は、困難です。

マウスの中足骨、臓器の移植片培養、パイオランダの教授エリザベートバーガーらがoneered、 生体内 ¹⁸ に見られる文化の模倣で骨の成長率として軟骨内骨化し、骨の成長を研究するための非常に生理のex vivoモデルです。ユニーク、中足骨器官培養は、軟骨形成の異なる段階で軟骨細胞の検査を可能にするため、文化^19-21における細胞よりもin vivoの状況に近い条件を提供する、細胞-細胞および細胞-マトリックス相互作用を維持します。また、このモデルは、一次軟骨細胞培養は不可能である線形骨成長の直接的検査を可能にします。また、そのため、成長板のローカル効果の具体的な分析を可能に全身および局所因子の分離を可能にします。

中足骨の文化は、多数のパラメータの調査を可能にします。全長のとの鉱化地域の毎日の測定値基礎は、標準的な位相差顕微鏡及び画像解析ソフトウェアを用いて行うことができます。 in situハイブリダイゼーションおよび免疫組織染色で組織学は、容易に両方の細胞および分子実体の空間分解能、従来の細胞培養方法に比べて大きな利点を可能にする、中足骨切片上で実施してもよいです。免疫組織化学的手法は、軟骨細胞^22を増殖することにより5-ブロモ-2'-デオキシウリジン（BrdU）の取り込みの検出および定量を含んでいます。また、中足骨組織のさらなる処理は、mRNA発現（RT-qPCRの）、タンパク質および細胞内シグナル伝達の解析（ウエスタンブロット）、または脂質組成（質量分析）の下流の分析を可能にするために行われてもよいです。これまでのほとんどの研究は、出生後の動物から培養した胚性中足骨ではなく、中足骨を使用します。両方のモデルが有益であることができる一方で、胚の骨の研究は、いくつかの利点があります：彼らは速く成長し、exploすることができます鉱化プロセス^23-25の開始および進行を研究するited。

このプロトコルは、詳細に胚15日目（E15）は、マウス胚の後肢から胚中足骨の複雑な解剖を説明します。また、解剖学的に別個の中足骨の成長と鉱化作用が示されています。