Cultuur van muizen embryonale Middenvoetsbeentjes: Een Fysiologische Model van endochondrale Verbening

Het skelet is een zeer complexe, dynamische en complexe orgaan dat een scala aan functies variërend van motoriek heeft, om ion homeostase. Bestaande uit bot en kraakbeen, het skelet bestaat uit functioneel verschillende celpopulaties die werken handhaven het structurele, biochemische en mechanische integriteit ^1. Een van de belangrijkste functies van het skelet een rol in de ontwikkeling en groei. Deze processen vereisen de orkestratie van meerdere cellulaire populaties die zijn geregeld door nauwe endocriene en genetische controle.

Met uitzondering van de platte botten zoals scapula, schedel en borstbeen, wordt de zoogdier skelet gevormd door het proces dat endochondrale ossificatie. Hierbij gereguleerd zowel moleculair als ruimtelijk begint met de condensatie van mesenchymale cellen hoofdzakelijk afkomstig van de mesoderm ^2. Onder invloed van de transcriptiefactor SOX9 cellen in the inwendige van de verdichtingen differentiëren tot chondrocyten, uitdrukken en afscheiden kraakbeen specifieke extracellulaire matrix (ECM) bestanddelen zoals type II collageen en aggrecan. Cellen in de marge van de condensatie, drukken type I collageen en vormen de perichondrium, de afbakening van de aspirant-bot ^3. Later, de osteoprogenitors van het perichondrium differentiëren in osteoblasten, gestuurd door de expressie van de transcriptiefactoren, Runx2 en osterix ^4. Dit leidt tot een overwicht van osteoblasten en deze laag wordt De periosteum die een gemineraliseerd bot kraag rond het middelste gedeelte van het bot vormt. Vasculaire penetratie van het periosteum en invasie van het kraakbeenachtige skelet optreedt en dus ook, haematopoetically afgeleide botresorberende cellen, osteoclasten, chondrocyten die resten en veel van de kraakbeenmatrix ⁵ resorberen. De ruimten gevormd wordt voorzien door osteoprogenitors die tot het primaire ossificatiecentrum dat geleidelijk de kern van de diafyse inneemt en fuseert met het periosteum. Andere cellen geven aanleiding tot beenmerg. Rond de geboorte, bloedvaten en osteoprogenitors dringen het kraakbeen matrix rijk aan weerszijden (epifyse) van de ontwikkeling diafyse de secundaire botvormingscentrum vormen. Gelegen tussen de epifyse en diafyse aan beide uiteinden van de lange botten is een band van het kraakbeen – de epifyse groeischijf – die verantwoordelijk is voor de coördinatie van de lineaire groei van alle lange botten ^6.

Chondrocyten in de groeischijf in eerste instantie laten groeien en vervolgens verder door morfologisch verschillende zones, gecoördineerd door sequentiële expressie van transcriptie en groeifactoren. Het hoogtepunt van deze gang van zaken is het verlaten van de celcyclus en hypertrofie van chondrocyten in het centrum van kraakbeen precursor. Hypertrofische chondrocyten sterk drukken het type X collageen en matrix metalloproteinase-13 (MMP13) en hun aanzienlijke uitbreiding volume richting lengtegroei levert de grootste bijdrage aan botgroei bij zoogdieren ^7,8. Bovendien hypertrofe chondrocyten mineraliseren hun omgeving ECM door het vrijkomen van matrix vesicles, membraan gebonden structuur gespecialiseerd voor de productie van amorf calciumfosfaat en deze verwerkt van fosfatasen (weefsel niet-specifieke alkalische fosfatase (TNAP) en PHOSPHO1) en calcium kanaliseren eiwitten (annexinen ) ^9-11. Deze verkalkte kraakbeen is binnengevallen door de bloedvaten van het onderliggende beenmerg als gevolg van osteoclasten werving en matrix resorptie. Dit wordt gevolgd door osteoblasten migratie en aanpassing aan het oppervlak van de verkalkte kraakbeen resten, waar ze voorzien in een laag van osteoid die snel gemineraliseerd. De geweven bot van de primaire spongiosa is later verbouwd tot lamellaire bot van de secundaire spongiosa ^12. Epifyse fusie resultaten in destopzetting van endochondrale ossificatie ^13.

Endochondrale ossificatie is onder strakke regulering door vele endocriene en paracriene hormonen en groeifactoren om verstoorde ontwikkeling en / of groei longitudinale been ¹⁴ voorkomen. Een beter begrip van de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze processen is daarom absoluut noodzakelijk in ons streven naar klinische vooruitgang in de richting van de menselijke voordeel. Eerder onderzoek naar de overeenkomsten en verschillen tussen de groei platen van verschillende leeftijden, locaties en soorten zijn sterk verbeterd ons begrip van de fysiologische mechanismen omliggende groeischijf dynamiek ^15,16. De studie van geïsoleerde chondrocyten moeilijk, het verwijderen van chondrocyten uit hun omgeving kan leiden tot dedifferentiatie, vergezeld van het verlies van expressie van belangrijke merkers zoals COL2A1 ^17.

De muis middenvoetsbeentje orgel explantaatkweek, pioneered door Prof. Elisabeth Burger en zijn collega's in Nederland, is een sterk fysiologisch ex vivo model voor het bestuderen van endochondrale botvorming en botgroei als de groei van de botten in de cultuur na te bootsen, dat gezien in vivo ^18. Uniek middenvoet orgelcultuur maakt het onderzoek van chondrocyten in verschillende fasen van chondrogenese en onderhoudt cel-cel en cel-matrix interacties, dus het verschaffen van omstandigheden dichter bij de in vivo situatie dan in kweek ^19-21. Bovendien is dit model zorgt voor een rechtstreeks onderzoek van lineaire botgroei die in primaire chondrocyten culturen niet mogelijk is. Het staat ook voor de scheiding van systemische en lokale factoren waardoor derhalve de specifieke analyse van de lokale effecten op de groei plaat.

De cultuur van de middenvoetsbeentjes maakt het onderzoek van talrijke parameters. Dagelijkse metingen van de totale lengte van de gemineraliseerde regiode rudimenten kan worden uitgevoerd met standaard fasecontrast microscopie en beeldanalyse software. Histologische, in situ hybridisatie en immunohistologische kleuring kan gemakkelijk worden uitgevoerd op middenvoet gedeelten, waardoor de ruimtelijke resolutie van zowel cellulaire en moleculaire entiteiten, een groot voordeel boven traditionele celcultuur methoden. De immunohistochemische aanpak omvat de detectie en kwantificering van 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU) opname door prolifererende chondrocyten ^22. Daarnaast kan verdere verwerking van metatarsale weefsels worden uitgevoerd om voor downstream analyse van mRNA expressie (RT-qPCR), eiwitten en intracellulaire signalering analyse (Western blotting) of lipidesamenstelling (massaspectrometrie). De meeste studies tot op heden gebruik van gekweekte embryonale middenvoetsbeentjes eerder dan middenvoetsbeentjes uit post-natale dieren. Hoewel beide modellen informatief kan zijn, de studie van de embryonale botten heeft een aantal voordelen: ze sneller groeien en kan explo zijnperkt de initiatie en progressie van de mineralisatie proces ^23-25 bestuderen.

Dit protocol beschrijft in detail de ingewikkelde dissectie van de embryonale middenvoetsbeentjes uit de achterste ledematen van de embryonale dag 15 (E15) muizen embryo's. Bovendien is de groei en mineralisatie van anatomisch verschillende middenvoetsbeentjes getoond.