サイレージのメタゲノム解析

1.サイトの場所このようなファームとして適切なサイトからサイレージのサンプルを収集します。ここでは、ファームはBallydulea、株式会社コーク、アイルランド（51°51'58.4 "N 8°16'48.7" W）に位置していました。 2. DNA抽出注：DNA抽出は、製造業者の説明書に従って市販のキットを用いて行きました。何のサンプルが含まれていないネガティブコントロールは、ライブラリー調製方法全体で使用されました。 供給された溶解チューブに978μLのリン酸ナトリウム緩衝液122μL土壌溶解緩衝液に試料400mgの – 100を追加します。 6.0メートル/秒の速度で40秒間均質化に溶解チューブを配置することによって、サンプルを均質化します。 15分間14,000×gで遠心分離溶解物およびタンパク質沈殿溶液（PPS）の250μLを含むクリーンなマイクロ遠心チューブに上清を移します。 10回と遠心機を反転させることにより溶液を混合5分間、14,000×gで。 きれいな15 mL遠心チューブに1 mLのDNA結合マトリックスに上清を追加します。 3分間絶えずチューブを反転させた溶液を混ぜます。次いで、混合物を、3分間沈降上清の500μLを破棄することができます。残りの上清を混ぜます。 1分間14,000×gでスピンフィルターや遠心分離機にサスペンションの600μLを転送します。ろ液を捨て、残りの懸濁液で処理を繰り返します。 その後、1分間14,000×gで遠心し、ピペッティングにより混合し、スピンフィルター内のDNA結合マトリックスへの洗浄緩衝液500μLを加えます。 ろ液を捨て、すべての洗浄緩衝液が除去されていることを確認するために2分間、14,000×gで再びスピンフィルターを遠心してください。 5分間23℃でのスピンフィルターを乾燥させます。 （70℃）DNアーゼを含まない水（DES）プリ暖かく、スピンフィルター内のDESの100μLで再懸濁DNA結合マトリックス。きれいな1.5 mLのマイクロ遠心機TUにスピンフィルターを転送DNAを溶出するために1分間14,000×gであること、および遠心分離機。さらなる分析が行われるまで-20℃で精製したDNAを保管してください。 DNA精製ビーズを用い3. DNA精製注：以前抽出したDNA試料が得られた純粋なDNAを確実にするために、精製ビーズを用いて精製したメタゲノムライブラリーの調製に関する。 使用前に30分間23℃でビーズをインキュベートします。 DNAサンプルにビーズの2ボリュームを追加し、5分間23℃で溶液をインキュベートします。 5分間分離磁石の上にサンプルを置き、その後、上清を捨てます。 200μLの新鮮な80％エタノール（エタノール）で2回ビーズを洗浄してください。空気を10分間ビーズを乾燥させます。 分離磁石からサンプルを削除し、溶出緩衝液（EB）の50μLを追加し、ピペッティングにより混合します。 これは後に戻って3分間分離磁石の上にサンプルを置き、5分間23℃でサスペンションをインキュベートします。 Trのきれいなチューブに、DNAを含む上清を、ansfer。ビーズを捨てます。 セクション4に従って精製されたDNAを定量化します。 精製されたDNAの4定量注：精製DNAを、製造業者の説明書に従って蛍光および二本鎖（二本鎖DNA）高感度（HS）アッセイキットを用いて定量しました。 試薬にバッファの1比：199を使用して、ワーキング溶液を調製します。 ワーキング溶液190μLに各DNA標準の10μLを追加します。 ワーキング溶液190μLに精製されたDNAの10μLを追加します。最終容量は200μLでなければなりません。 2分間23℃での標準およびDNAサンプルをインキュベートします。 画面上の指示を使用して、蛍光光度計でのDNAサンプルの前に基準を分析します。 5.ショットガンシーケンシングライブラリの準備注：ショットガンシーケンシングライブラリーAを用いて調製しました。製造元の指示を使用して、市販のライブラリー調製キット。 EBを使用して、0.2 ngの/μLにDNA試料を希釈します。すでにこの濃度未満である任意のサンプルは、ネガティブコントロール、すなわち 、現在の濃度で残されています。 10μLのバッファーと5μL酵素ミックスで精製されたDNAの5μLを混ぜます。 5分間55℃でサンプルをインキュベートします。 バッファを中和する5μLを加え、5分間23℃で溶液をインキュベートします。 サンプルの特定の塩基配列決定の指標のそれぞれの5μL、15μLのPCRマスターミックスを追加します。 サーモサイクラーで、10秒、30秒55℃、30秒間72℃、95℃の12サイクルの前に、3分、30秒95℃、72℃でサンプルをインキュベートします。 5分間72℃で、最終的にサンプルをインキュベートします。 前としてではなくEBの30μLの最終溶出とビーズ精製を用いて調製されたDNAを精製します。 6. Library数量と品質チェック注：準備ライブラリの量と質は、市販のキットおよび器具を用いて評価しました。 使用前に30分間23℃のキット成分をインキュベートします。 2000 rpmで1分間のバッファと渦の2μLにDNAの2μLを追加します。 それはチューブの底にあることを確認するために、サンプルをスピンダウン。 機器にサンプル管、分析テープやヒントを挿入し、ソフトウェアによって指示されるように分析を行います。 7. DNAシーケンシング 300bpのペアエンドシーケンシング45を使用して、シークエンシングサービスやシーケンスに準備し、定量化されたDNAシーケンシングライブラリのサンプルを転送します。 生配列データの8解析注記：Linuxオペレーティングシステムを使用して、各プログラムのコマンドは、プロトコルのステップの下に示されています。 sのために使用されるパイプラインequenceデータ分析は、図1に示されています。プログラムは、分析前にユーザーによってインストールされるべきです。このプロセスは、各試料について個別に行われるべきです。 raw_read1.fastq raw_read2.fastqを読み込んで分析し、視覚化FastQC 46を使用して、DNA配列データをコマンドライン/パスからファイルへ/ fastqcに入力することで、前方に続いて、生を逆転。 -o output_fastqcと-f FASTQによって生の読み取りファイルのファイル形式を入力して、出力フォルダを指定します。 出力ファイル（ 図2）を表示します。 パスからファイルへ/ fastqc raw_read1.fastq raw_read2.fastq -o OUTPUT_DIRECTORY -f FASTQ。 9.品質管理のトリミングとフィルタリングシーケンスデータコマンドラインのjava -jar /パスからファイルへ/ trimmomatic-0.35.jarに入力することで、トリミングプログラム、Trimmomatic 28を実行します 。 指定したファイルは「PE」を入力して、エンドファイルを対になっています。国家その16中央広報ocessing装置（CPU）は、-threads 16を入力して、プログラムによって使用されるべきです。 生の前方の名前を入力して、QCチェックに2つのファイルを一覧表示し、読み込み逆。出力ファイルの接頭辞が-baseoutサイレージを入力することによって決定されます。 ILLUMINACLIPを入力して、プログラムのオプションを定義します。NexteraPE-PE.fa：2：30：10 LEADING：3 TRAILING：3 SLIDINGWINDOW：4：20 CROP：200 HEADCROP：15 MINLEN：36。 完了したら、以前のようにFastQCを使用してトリミングされた配列を分析し、成功したトリミングを保証するために、生の配列データに出力を比較します。 注：ソフトウェアツール、Trimmomaticは、（品質3以下）低品質またはN基盤の末尾に、各4塩基ワイドスライディングウィンドウで読み取るスキャンの除去、（品質3以下）をリードする低品質またはN塩基を除去することにより、さらに読み込みトリミング。パラメータは、塩基当たり平均品質はいずれも36塩基長の下読み込みドロップし、次に20を下回ったとき切断するため設定しました。最後に、15塩基がfrのクロップましたオムそれぞれの頭を読み取り、読み取りの開始から200塩基を維持するためにトリミングされた読み取り。長い（> 200塩基対）を読み込むを配列決定すると、この最後のステップは、いくつかの品質の問題を克服するために行きました。これらは、特定のサンプル28のために調整することができます。 ます。java -jar /path-to-file/trimmomatic-0.35.jar PE -threads 16 raw_read1.fastq raw_read2.fastq -baseoutサイレージILLUMINACLIP：NexteraPE-PE.fa：2：30：10 LEADING：3 TRAILING：3 SLIDINGWINDOW：4 ：20 CROP：200 HEADCROP：15 MINLEN：36 10.メタゲノムアセンブリ不対をマージ、トリミング読み取り不対に続いて猫を入力して読み込みます。 silage_read2_unpaired.fastq silage_read1_unpaired.fastq。 > silage_merged_unpaired.fastqを入力して新しいファイルにファイルを書き込みます猫silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq> silage_merged_unpaired.fastq デノボに、配列決定されたDNAを組み立てる入力/パスにすることによりスペード（サンクトペテルブルクゲノムアセンブラ）30を使用-file / spades.py。 16のCPUが16を-t入力して、およびメタゲノムパラメータが–meta入力して適用されるべきであることに使用されることを指定します。 前方にトリミングされた識別することは使用して-1 silage_read1_paired.fastqを読み取り、逆は-2 silage_read2_paired.fastqによって読み取ります。マージされた不対は、-s silage_merged_unpaired.fastqによって指定されている読み込みます。 -o silage_spadesを入力して、出力フォルダを定義します。 パスからファイルへ/ spades.py -t 16 –meta -1 silage_read1_paired.fastq -2 silage_read2_paired.fastq -s silage_merged_unpaired.fastq -o silage_spades 11.ペアエンドリードオーバーラップ DNA配列のペアをマージするには、コマンドライン/パスからファイルへの/フラッシュメモリに入力することにより、FLASH（ショートの高速長さ調節が読み込み）29を使用して読み込みます。 16のCPUが-oサイレージを入力して、16と出力接頭辞を-t使用することによって使用されるべきであることを指定します。 silage_trimmed_R1.fastq silage_trimmed_R2.fastqを入力することで読み込みトリミング識別 1 -tパスからファイルへの/フラッシュ6 -oはsilage_read1_paired.fastq silage_read2_paired.fastqを点滅しました 12.分類学的分類タイプ/パス・ツー・ファイル/クラーケンと–db /パスからファイルへ/標準を入力して、データベースを指定します。 16のCPUが–threads 16を入力して使用されるべきであることを定義し、FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt –output使用して出力フォルダを識別します。入力ファイル名を入力します。 FLASHed_silage.extendedFrags.fastq パスからファイルへ/クラーケン–db標準–thread 16 –output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt FLASHed_silage.extendedFrags.fastq 注：クラーケン7を使用して組み立てられたDNA配列足場の分類は、利用可能なすべての原核生物ゲノム配列を含ま最近、標準クラーケンデータベースに対して完了しました。 カットを入力して、出力ファイルから、新しいファイルに列2および3を転送-f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt> FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int <li> Webブラウザで出力ファイルを開きます。 カット-f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt> FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int ktImportTaxonomyを入力して、クローナ12に新しいファイルをインポートします。 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.intを入力して、入力ファイルを指定します。 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.htmlを-o入力して、出力ファイルを確認します。 パスからファイルへ/ ktImportTaxonomy FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html 13.機能アノテーション MG-RAST 47ウェブサイト、http://metagenomics.anl.gov/に移動します。必要に応じて新規ユーザーとして登録します。ログイン後、「アップロード」ボタンをクリックします。ステップ10から組み立てた足場をアップロードします。 ファイルをアップロードしたら、「送信」し、指示に従ってくださいにクリックして、分析の完了を待っています。 分析が完了した後、EM を介して送信されるリンクを表示MG-RASTからAIL、または代替的には、「進歩」をクリックしてください。完了したジョブのリストがあります。当該ジョブIDにしてから「ダウンロードページ」へのリンクをクリックしてください。 ダウンロードページで、見出しの下に「プロテインクラスタリング90％」、予測されたタンパク質のファイル、550.cluster.aa90.faaをダウンロードするには、タンパク質ボタンをクリックしてください。 推定される特定のCAZY酵素クラスに属するタンパク質を分類するために、CAZYデータベース48にダウンロードしたタンパク質を比較します。ファイルから炭水化物活性酵素データベース（CAZY）をダウンロードし、次のとおりです。AA.zip、CE.zip、GH.zip、GT.zipとPL.zip。炭水化物エステラーゼ（CE）、補助活動（AA）、グリコシダーゼ（GH）、グリコシルトランスフェラーゼ（GT）と多糖リアーゼ（PL）：これらのファイルは、それぞれ以下の酵素のクラスを表します。 データベース・ファイルを解凍し、USEARCH UBLAST ALGORを使用してCAZYデータベースタンパク質へのタンパク質の類似性を決定することにより、タンパク質に注釈を付けますITHM 49。 5データベース.txtファイルの種類を反復処理する（*の.txtで私のために）bashのループを使用するには、「* .txtとで私のために、やります」。 ublastアルゴリズムを使用するためには、パラメータ-ublastと入力する/パス・ツー・ファイルを/ usearch8によってUSEARCHを実行します。そして、MG-RAST、「mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa」からダウンロードしたタンパク質配列ファイルの名前を入力。 データベースファイルを示すために"$ iは-db」と1E -5でE-値のしきい値を指定するタイプ、タイプ「-evalue 1E-5」を使用します。 標的配列の発見後、検索を終了し、したがって、標的酵素クラス、 例えば GH、タイプ「-masaccepts 1」に属するものとして、そのタンパク質配列を分類します。 16のCPUがタイプ "-threads 16」を使用する必要があるとATAB区切りのテキストタイプ」-blast6out」として出力ファイルの形式を指定することを定義します。出力ファイル・タイプの "$ i.ublast」を識別するために。トン、bashのループを終了するにはYPE ";行わ" * .txtとでiについて。 やる/パス・ツー・ファイルを/私は-evalue usearch8 -ublast ../mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa -db $ 1E-5 -maxaccepts 1 -threads 16 $ i.ublast -blast6out。 終わりました 14.可視化CAZYアノテーションベン図としてCAZY注釈からの出力を視覚化するために、bashのループを使用して、各酵素のクラスのタンパク質IDリストを生成します。 "*の.ublastで私のために、やる」タイプ。 出力ファイルから、新しいファイルに列1を転送するには、タイプ「猫は$ iが| -f 1> $のi.listを切ります」。 ループと種類を終了 ";済」。 テキストエディタでの.listファイルを開きます。 Webサイトにアクセスし、5のようにセット数を選択して、個別のボックス内の各リストファイルの内容を貼り付けます。 .SVGファイルとして結果の図をダウンロードしてください。 I IN * .ublastため。 |猫の$ iが行います-f 1> $ i.listカット。 終わりました