Yemlerin metagenomic Analizi
Summary
Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.
Abstract
Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to “operational taxonomic units”; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage.
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.
Introduction
Metagenomiks DNA'nın doğrudan analizi çevre örnekleri 1 içinde bulunan biyolojik toplulukların saflaştırılmış ve ilk sediment 2'de bulunan Kültüre edilemeyen bakteri tespit etmek için kullanılır idi. Metagenomiks yaygın olarak, insan mikrobiyomu 3 belirleme okyanus 4 içinde ve hatta kahve makineleri 5 üzerinde geliştirmek bakteri topluluklarının analizi için mikrobiyal nüfusu sınıflandırılması gibi uygulamalar, bir dizi için kullanılır olmuştur. Yeni nesil dizileme teknolojileri tanıtılması büyük sıralama hacmi ve çıkış sonuçlandı. Sonuç olarak, DNA dizilemesi, 6 daha ekonomik hale gelmiştir ve gerçekleştirilebilir sekanslama derinliği büyük ölçüde güçlü bir analitik araç haline metagenomics sağlayan artmıştır.
Metagenomic sıralama pratik, moleküler açıdan "Front-end" geliştirmeleri in büyümesini tahrik vartaksonomik sınıflandırma 7-9, fonksiyonel açıklama 10,11 ve DNA sekans verileri görsel temsilini 12,13 kullanılabilir siliko biyoinformatik araçları. Mevcut sayısının artması, kaçınılmaz sıralı genomları 15 bir "arka uç" referans veritabanı karşı gerçekleştirilen mikrobiyal topluluklar, sınıflandırılmasında daha hassasiyet sağlayan prokaryotik ve ökaryotik 14 genomları sıralı. Iki temel yaklaşım metagenomic analiz için kabul edilebilir.
Daha geleneksel bir yöntem, bakteriyel genom bölgesini kodlayan 16S rRNA geninin analizidir. 16S rRNA yüksek prokaryot türler arasında korunmuş ancak dokuz hiper-değişken bölgeleri sergiler (V1 – V9) türleri tanımlama 16 için istismar edilebilir. uzun dizileme giriş (≤ 300 bp eşleştirilmiş sonu), özellikle de iki hiper değişken bölgeleri kapsayan DNA sekanslarının analizi için izinV3 – V4 bölgesi 17. Böyle Oxford Nanopore 18 ve PacBIO 19 gibi diğer sıralama teknolojileri, ilerlemeler tüm 16S rRNA gen bitişik sıralı izin yoktur.
16S rDNA göre kütüphaneleri türlerin belirlenmesi için hedeflenen bir yaklaşım sağlar ve doğal saflaştınlmış numuneler içinde meydana düşük kopya sayısı DNA algılanmasını sağlamak da, av tüfeği sıralama kütüphaneleri ya da 16S çoğaltılabilir olmayan DNA bölgeleri içerebilir türlerinin tespiti için izin rRNA işaretleyici astar dizileri kullanılan, ya da şablon dizisi ve yükseltme primer dizisinin arasındaki farklar 20,21 çok büyük çünkü. DNA polimerazlar, DNA replikasyon yüksek aslına olmasına rağmen başka, taban hataları yine PCR amplifikasyonu sırasında oluşabilir ve bu dahil hataları türler 22 menşeli hatalı sınıflandırma ile sonuçlanabilir. Şablon SEQ PCR amplifikasyonu ayrımcıDİZİLERİ da oluşabilir; Kullanılan nihai amplikon, havuzda gibi timin glikol gibi 23 ve benzer şekilde, doğal olmayan baz modifikasyonları temsil altında yüksek bir GC içeriğine sahip DNA dizileri, DNA polimeraz 24 dizileri DNA'nın çoğaltılmasında hatalarına neden durdurmak için olabilir. Buna karşılık, bir av tüfeği sıralama DNA kütüphanesi bir numune çıkarılır ve daha sonra önceden sekanslama için hazırlık için daha kısa DNA zinciri uzunluklarda parçalanmış olan saflaştırılmış DNA tümü kullanılarak hazırlanmıştır bir DNA kütüphanesidir. Finansal maliyet güvenilir bir dizi derinliği amplikon sekanslama 26 daha büyüktür ulaşmak için gerekli olsa da tüfek dizilemesi ile oluşturulan DNA dizilerinin taksonomik sınıflandırma, 16S rRNA dizilemesi amplikon 25 daha doğru karşılaştırılır. av tüfeği sıralama Metagenomiks büyük yararı olmuştur kez numune çeşitli genomlar sıralı bölgeleri gen zenginleştirilmesi için kullanılabilir olmasıdırtaksonomik 27 sınıflandırılmıştır.
Metagenomic dizi verileri biyoinformatik araçlar giderek artan aralığı ile analiz edilir. Bu araçlar, örneğin, uygulamalar geniş bir yelpazede gerçekleştirmek için edebiliyoruz, eşleştirilmiş ucunun üst üste ham dizi verilerinin 28 kalite kontrol analizleri, dizinin de novo montaj komşularla ve iskeleler 30,31, taksonomik sınıflandırma ve görselleştirme okur 29 okur dizisi okur ve dizileri 7,12,32,33 ve monte dizilerin 34,35 fonksiyonel ek açıklama toplandı evi.
Mısır gibi fermente tahıllar (Zea mays) dan dünya çapında çiftçiler tarafından üretilen silaj, ağırlıklı olarak büyükbaş hayvan yemi olarak kullanılır. Silaj bakteri Lactobacillus sp ile işlenir. fermantasyon 36 yardım ancak bugüne kadar, silaj bulunan diğer mikrobiyal populasyonların sınırlı bilgi var etmek. Fermentn süreci silaj 37 içinde yaygın hale istenmeyen ve zararlı mikro-organizmaların yol açabilir. Maya ve küf ek olarak, bakteri silaj fermente anaerobik ortam yapılarına uyarlanabilir ve daha sık çiftlik hayvanlarında hastalıkların yerine silaj 38 bozulması ile ilişkilidir. Silaj siloları doldurma ve böylece silaj 39 pH artan bütirik asit, laktik asit, anaerobik sindirim ürünü dönüştürmek mümkün olduğunda yanlışlıkla topraktan eklenebilir bütirik asit bakterileri kalır. PH bu artış normal, optimum silaj fermantasyon koşulları 38 altında büyümeyi sürdürmek mümkün olacağını bozucu bakterilerin bir yükselişe yol açabilir. Clostridium spp. Listeria spp. ve Bacillus spp. Gastr hayatta bakteri sporlarına olarak, özellikle süt sığırı yemi silajında, özel bir önem taşıyorointestinal yolu 40 hayvan ve insan ölümlerine 37,39,41-44 için, nadir durumlarda, gıda zinciri girmek gıda bozulmaları yol ve olabilir. o silaj bozulma nedeniyle veteriner tedavisi ve hayvancılık kaybının tam ekonomik etkilerini tahmin etmek zor Dahası, bir salgın meydana gelmesi ise bir çiftlik zararlı olması muhtemeldir.
Metagenomic yaklaşım kullanarak biz olmak iyileştirici önlemler sağlayan, silaj örneklerinde mevcut mikrobiyal nüfusu sınıflandırmak ve ayrıca da, potansiyel olarak hayvancılık üzerinde zararlı bir etkisi olurdu silaj bozulma ile ilişkili mikrobiyal topluluklar belirleyebilir varsayılmaktadır silaj önce alınan bir besin kaynağı olarak kullanılmak üzere.
Protocol
Representative Results
Discussion
Siliko analizinde bir çevresel örneklerin içinde mevcut olan mikrobiyal topluluklar için mükemmel bir fikir verebilir iken, taksonomik sınıflandırmaların ilgili kontroller ile birlikte ve sıralama uygun bir derinlik bütününü yakalamak için elde edildiğini yapılabilir göstermiştir kritik olduğunu 51 mevcut nüfus.
herhangi bir hesaplama analizi ile, benzer bir hedefe ulaşmak için birçok yollar vardır. Bu çalışmada kullanılan metodlar silaj mikrobiyomları üzerinde analizler bir dizi elde etmek için bir araya getirildi uygun ve basit yöntemler, örnekleridir. Çeşitli ve biyoinformatik araçları ve teknikleri giderek artan sayıda örneği Phylosift 8 ve MetaPhlAn2 52 için, metagenomic verileri analiz etmek için kullanılabilir ve bu numunenin kendi alaka soruşturma ve analiz req öncesinde değerlendirilmelidir53 edinilmiş. Metagenomic analiz yöntemleri sınıflandırma, sıralama derinliği ve sıralama kalitesi için kullanılabilir için veritabanları ile sınırlıdır.
Burada gösterilen biyoinformatik işleme yerel, yüksek enerjili makinede yapıldı; Ancak bulut tabanlı sistemler de mevcuttur. Bu bulut tabanlı hizmetler, uygun bir güçlü yerel iş istasyonunda yüksek maliyetli yatırımı kalmadan gerekli hesaplama gücü kiralama için izin verir. Bu yöntemin bir potansiyel uygulama bu nedenle gıda zincirine girmesini engel hiçbir zararlı bakteri mevcut olduğundan emin olmak için tarımda kullanılmadan önce silaj değerlendirmek olacaktır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Andrew Bird for the silage samples and Audrey Farbos of the Exeter Sequencing Service for her assistance in preparing DNA sequencing libraries. Exeter Sequencing Service and Computational core facilities at the University of Exeter. Medical Research Council Clinical Infrastructure award (MR/M008924/1). Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (WT097835MF), Wellcome Trust Multi User Equipment Award (WT101650MA) and BBSRC LOLA award (BB/K003240/1).
Materials
| FastDNA SPIN Kit for Soil | MP Bio | 116560200 | DNA Extraction |
| DNA FastPrep | MP Bio | 116004500 | DNA Extraction |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA Purification |
| Elution Buffer | Qiagen | 19806 | DNA Purification |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | DNA Quantification |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | DNA Quantification |
| Nextera XT DNA Library Prep Kit | Illumina | FC-131-1024 | Library Preparation |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | Library Preparation |
| TapeStation 2200 | Agilent | G2964AA | DNA Quantification |
| HS D100 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | DNA Quantification |
| HS D100 ScreenTape Reagents | Agilent | 5067-5585 | DNA Quantification |
| TapeStation Tips | Agilent | 5067-5153 | DNA Quantification |
| TapeStation Tubes | Agilent | 401428 and 401425 | DNA Quantification |
| HiSeq 2500 | Illumina | DNA Sequencing – provided by a sequencing service | |
| High Power Analysis Workstation | Various | Local or cloud based, user preferred system |
References
- Riesenfeld, C. S., Schloss, P. D., Handelsman, J. Metagenomics: genomic analysis of microbial communities. Annu. Rev. Genet. 38 (1), 525-552 (2004).
- Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59 (1), 143-169 (1995).
- Human Microbiome Project Consortium. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
- Venter, J. C., et al. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science. 304 (5667), 66-74 (2004).
- Vilanova, C., Iglesias, A., Porcar, M. The coffee-machine bacteriome: biodiversity and colonisation of the wasted coffee tray leach. Sci. Rep. 5, 17163 (2015).
- Hayden, E. C. Technology: The $1,000 genome. Nature. 507 (7492), 294-295 (2014).
- Wood, D. E., Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Gen. Biol. 15 (3), 46 (2014).
- Darling, A. E., et al. PhyloSift: phylogenetic analysis of genomes and metagenomes. PeerJ. 2 (12), 243 (2014).
- Buchfink, B., Xie, C., Huson, D. H. Fast and sensitive protein alignment using DIAMOND. Nat. Meth. 12 (1), 59-60 (2015).
- Moreno-Hagelsieb, G., Hudy-Yuffa, B. Estimating overannotation across prokaryotic genomes using BLAST+, UBLAST, LAST and BLAT. BMC Res Notes. 7 (1), 651 (2014).
- Hauser, M., Steinegger, M., Söding, J. MMseqs software suite for fast and deep clustering and searching of large protein sequence sets. Bioinf. 32 (9), 1323-1330 (2016).
- Ondov, B. D., Bergman, N. H., Phillippy, A. M. Interactive metagenomic visualization in a Web browser. BMC Bioinf. 12, (2011).
- Kolde, R., Vilo, J. GOsummaries: an R Package for Visual Functional Annotation of Experimental Data. F1000Res. 4, 574 (2015).
- Reddy, T. B. K., et al. The Genomes OnLine Database (GOLD) v.5: a metadata management system based on a four level (meta)genome project classification. Nuc. Aci. Res. 43 (1), 1099-1106 (2015).
- Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinf. 10 (1), 421 (2009).
- Chakravorty, S., Helb, D., Burday, M., Connell, N., Alland, D. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. J. Micro. Met. 69 (2), 330-339 (2007).
- Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (1), 6 (2014).
- Mikheyev, A. S., Tin, M. M. Y. A first look at the Oxford Nanopore MinION sequencer. Molecular Ecology Resources. 14 (6), 1097-1102 (2014).
- Schadt, E. E., Turner, S., Kasarskis, A. A window into third generation sequencing. Hum. Mol. Genet. 20 (4), 853-853 (2011).
- Shapiro, B., Hofreiter, M. A Paleogenomic Perspective on Evolution and Gene Function: New Insights from Ancient DNA. Science. 343 (6169), 1236573 (2014).
- Der Sarkissian, C., et al. Ancient genomics. Phil. Trans. R. Soc. B. 370 (1660), (2015).
- Patin, N. V., Kunin, V., Lidström, U., Ashby, M. N. Effects of OTU Clustering and PCR Artifacts on Microbial Diversity Estimates. Microb Ecol. 65 (3), 709-719 (2013).
- McInroy, G. R., Raiber, E. -. A., Balasubramanian, S. Chemical biology of genomic DNA: minimizing PCR bias. Chem. Commun. 50 (81), 12047-12049 (2014).
- Aller, P., Rould, M. A., Hogg, M., Wallace, S. S., Doublié, S. A structural rationale for stalling of a replicative DNA polymerase at the most common oxidative thymine lesion, thymine glycol. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 814-818 (2007).
- Ranjan, R., Rani, A., Metwally, A., McGee, H. S., Perkins, D. L. Analysis of the microbiome: Advantages of whole genome shotgun versus 16S amplicon sequencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 469 (4), 967-977 (2016).
- Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
- Li, X., Rao, S., Wang, Y., Gong, B. Gene mining: a novel and powerful ensemble decision approach to hunting for disease genes using microarray expression profiling. Nuc. Aci. Res. 32 (9), 2685-2694 (2004).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies. Bioinf. 27 (21), 2957-2963 (2011).
- Bankevich, A., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 19 (5), 455-477 (2012).
- Nurk, S., Meleshko, D., Korobeynikov, A. . metaSPAdes: a new versatile de novo metagenomics assembler. , (2016).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
- Tanaseichuk, O., Borneman, J., Jiang, T. Phylogeny-based classification of microbial communities. Bioinf. 30 (4), 449-456 (2014).
- Bose, T., Haque, M. M., Reddy, C., Mande, S. S. COGNIZER: A Framework for Functional Annotation of Metagenomic Datasets. PLoS ONE. 10 (11), 0142102 (2015).
- Sharma, A. K., Gupta, A., Kumar, S., Dhakan, D. B., Sharma, V. K. Woods: A fast and accurate functional annotator and classifier of genomic and metagenomic sequences. Genomics. 106 (1), 1-6 (2015).
- Eikmeyer, F. G., et al. Metagenome analyses reveal the influence of the inoculant Lactobacillus buchneri CD034 on the microbial community involved in grass ensiling. J. Biotech. 167 (3), 334-343 (2013).
- Driehuis, F., Elferink, S. J. W. H. O. The impact of the quality of silage on animal health and food safety: A review. Vet. Quart. 22 (4), 212-216 (2000).
- Dunière, L., Sindou, J., Chaucheyras-Durand, F., Chevallier, I., Thévenot-Sergentet, D. Silage processing and strategies to prevent persistence of undesirable microorganisms. Anim Feed Sci Technol. 182 (1-4), 1-15 (2013).
- Vissers, M. M. M., et al. Minimizing the Level of Butyric Acid Bacteria Spores in Farm Tank Milk. J. of Dairy Sci. 90 (7), 3278-3285 (2007).
- Te Giffel, M. C., Wagendorp, A., Herrewegh, A. Bacterial spores in silage and raw milk. Antonie van. , (2002).
- Wiedmann, M. ADSA Foundation Scholar Award-An Integrated Science-Based Approach to Dairy Food Safety: Listeria monocytogenes as a Model System. J. of Dairy Sci. 86 (6), 1865-1875 (2003).
- Low, J. C., Donachie, W. A review of Listeria monocytogenes and listeriosis. Vet J. 153 (1), 9-29 (1997).
- Schoder, D., Melzner, D., Schmalwieser, A. Important vectors for Listeria monocytogenes transmission at farm dairies manufacturing fresh sheep and goat cheese from raw. J.Food. , (2011).
- Lindström, M., Myllykoski, J., Sivelä, S., Korkeala, H. Clostridium botulinumin Cattle and Dairy Products. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 50 (4), 281-304 (2010).
- Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456 (7218), 53-59 (2008).
- Andrews, S. . Babraham Bioinformatic- FastQC: A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. , (2015).
- Keegan, K. P., Glass, E. M., Meyer, F. FMG-RAST, a Metagenomics Service for Analysis of Microbial Community Structure and Function. Methods Mol. Biol. 1399, 207-233 (2016).
- Cantarel, B. L., et al. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nuc. Aci. Res. 37, 233-238 (2009).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinf. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Heberle, H., et al. InteractiVenn: a web-based tool for the analysis of sets through Venn diagrams. BMC Bioinf. 16 (1), 213 (2015).
- Ni, J., Yan, Q., Yu, Y. How much metagenomic sequencing is enough to achieve a given goal. Sci. Rep. 3, 1968 (2013).
- Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nat. Meth. 12 (10), 902-903 (2015).
- Oulas, A., et al. Metagenomics: tools and insights for analyzing next-generation sequencing data derived from biodiversity studies. Bioinform Biol Insights. 9 (9), 75-88 (2015).
