Сочетание мокрой и сухой методы Lab в Руководстве по кристаллизации больших биспиральных, содержащих белки
Summary
We describe a framework incorporating straightforward biochemical and computational analysis to guide the characterization and crystallization of large coiled-coil domains. This framework can be adapted for globular proteins or extended to incorporate a variety of high-throughput techniques.
Abstract
Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are found throughout nature, however, because of their physical properties and tendency to aggregate, they are traditionally viewed as being especially difficult to crystallize. Here, we utilize a variety of quick and simple techniques designed to identify a series of possible domain boundaries for a given coiled-coil protein, and then quickly characterize the behavior of these proteins in solution. With the addition of a strongly fluorescent tag (mRuby2), protein characterization is simple and straightforward. The target protein can be readily visualized under normal lighting and can be quantified with the use of an appropriate imager. The goal is to quickly identify candidates that can be removed from the crystallization pipeline because they are unlikely to succeed, affording more time for the best candidates and fewer funds expended on proteins that do not produce crystals. This process can be iterated to incorporate information gained from initial screening efforts, can be adapted for high-throughput expression and purification procedures, and is augmented by robotic screening for crystallization.
Introduction
Оборудование для определения структуры с помощью рентгеновской кристаллографии внес фундаментальный вклад в каждой области современной биологии; обеспечивая атомный вид макромолекул, которые поддерживают жизнь и как они взаимодействуют друг с другом в различных контекстах; что позволяет нам понять механизмы, которые вызывают болезни, и предоставляя возможность рационально разработать препараты для лечения болезни. Кристаллографии уже давно доминирующая экспериментальная методика определения макромолекулярной структуры, и в настоящее время составляет 89,3% от структурной базы данных (www.rcsb.org). Этот метод имеет много преимуществ, в том числе потенциал очень высокой разрешающей способности, способность визуализировать макромолекулы с широким диапазоном размеров, относительно легкого сбора данных, а также возможность представить, как макромолекула взаимодействует с растворителем, а в качестве лигандов.
Несмотря на многочисленные технологические улучшения в экспрессии рекомбинантного белка 1,2, PURфикация 3, и молекулярной биологии используются для создания этих систем 4, самым большим препятствием в процессе кристаллографической остается возможность выращивать кристаллы качества дифракции. Это особенно верно для белков, которые содержат большие домены биспиральных. Было подсчитано , что почти 5% всех аминокислот найдены в пределах намотанных катушек 5,6, что делает это очень распространенная структурная особенность 7, но эти белки часто более трудно очистить и кристаллизуются , чем глобулярных белков 8-10 , Это дополнительно усугубляется тем, что биспиральных домены часто встречаются в контексте более крупного белка, поэтому правильно предсказывать границы этих областей имеет решающее значение, чтобы избежать включения неструктурированной или гибкой последовательности, которая часто вредно для кристаллизации.
Здесь мы представляем концептуальную основу объединения веб-вычислительный анализ с experimentaл данные со скамейки, чтобы помочь пользователям через направляющие на начальных этапах кристаллографической процесса, включая: как выбрать фрагмент белка (ов) для структурных исследований, а также как подготовить и охарактеризовать образцы белка до попыток кристаллизации. Мы фокусируем наш анализ на двух белков, содержащих большие домены биспиральных, Shroom (ШРМ) и Rho-киназы (Rock). Эти белки были выбраны , поскольку они оба содержат домены биспиральных и , как известно, образуют биологически активные сложные 11-16. Shroom и Rho-киназы (Rock), по прогнозам, содержат ~ 200 и 680 остатков биспиральных соответственно, многие части которых были охарактеризованы структурно 17-20. Описанный здесь способ обеспечивает рационализировать рабочий процесс, чтобы быстро идентифицировать фрагменты биспиральных, содержащие белок, которые будут пригодны для кристаллизации, тем не менее, способы, описанные могут быть легко адаптированы для большинства белков или белковых комплексов или модифицированы включением высокой пропускной способностью approaчес как доступный. И, наконец, эти методы, как правило, недороги и могут быть выполнены пользователями практически на всех уровнях опыта.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь, предназначен, чтобы помочь пользователю определить границы доменов в пределах больших белков биспиральных для облегчения их кристаллизации. Протокол основан на целостном включение разнообразных данных из вычислительных предсказаний и других источников, ч…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grant NIH R01 GM097204 (APV and JDH). Funding for JHM was supplied by an HHMI Undergraduate Research Summer Fellowship.
Materials
| BL21(DE3) Rosetta | Emd Millipore | 70954-3 | |
| BL21(DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | |
| BL21(DE3) Codon Plus | Agilent Technologies | 230245 | |
| Lysozyme | Spectrum Chemical Mfg Corp | L3008-5GM | |
| Ni-NTA resin | Life Technologies | 25216 | |
| SubtilisinA | Spectrum Chemical Mfg Corp | S1211-10ML | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-160 | |
| INTELLI-PLATE 96: | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
| PEG 3350 | Hampton research | HR2-591 | |
| PEG 8000 | Hampton research | HR2-515 | |
| PEG 400 | Hampton research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton research | HR2-605 | |
| pcDNA3.1-Clover-mRuby2 | Addgene | 49089 | |
| Overnight Express Autoinduction System 1 | Emd Millipore | 71300 | |
| Lysogeny Broth powder | ThermoFisher Scientific | 12795027 |
References
- Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
- Chapman, T. Protein purification: pure but not simple. Nature. 434 (7034), 795-798 (2005).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. Predicting coiled coils from protein sequences. Science. 252 (5009), 1162-1164 (1991).
- Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils. J Struct Biol. 137 (1-2), 41-53 (2002).
- Lupas, A. N., Gruber, M. The structure of alpha-helical coiled coils. Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).
- Hernandez Alvarez, B., et al. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Eng Des Sel. 21 (1), 11-18 (2008).
- Slabinski, L., et al. The challenge of protein structure determination–lessons from structural genomics. Protein Sci. 16 (11), 2472-2482 (2007).
- Slabinski, L., et al. XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
- Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure. Curr Biol. 13 (24), 2125-2137 (2003).
- Hildebrand, J. D. Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network. J Cell Sci. 118 (Pt 22), 5191-5203 (2005).
- Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins. J Biol Chem. 281 (29), 20542-20554 (2006).
- Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction. Dev Dyn. 239 (7), 2078-2093 (2010).
- Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis. Mol Biol Cell. 22 (6), 795-805 (2011).
- Das, D., et al. The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice. Biol Open. 3 (9), 850-860 (2014).
- Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA. J Biol Chem. 279 (8), 7098-7104 (2004).
- Mohan, S., et al. Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology. PLoS One. 8 (12), e81075 (2013).
- Mohan, S., et al. Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction. Mol Biol Cell. 23 (11), 2131-2142 (2012).
- Tu, D., et al. Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I. PLoS One. 6 (3), e18080 (2011).
- Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol. 7, 539 (2011).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue. Anal Biochem. 48 (2), 617-620 (1972).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Jungbauer, A., Hahn, R. Ion-exchange chromatography. Methods Enzymol. 463, 349-371 (2009).
- Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography. J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).
- Giege, R. A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day. FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).
- Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination. Bioinformatics. 25 (14), 1761-1767 (2009).
- Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure. Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).
- Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).
- Elsliger, M. A., et al. The JCSG high-throughput structural biology pipeline. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).
- Bach, H., et al. Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies. J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).
- Strong, M., et al. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).
- Heras, B., Martin, J. L. Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).
