La combinazione di Wet and Dry tecniche di laboratorio per guidare la cristallizzazione di grandi dimensioni avvolto a spirale contenenti proteine
Summary
We describe a framework incorporating straightforward biochemical and computational analysis to guide the characterization and crystallization of large coiled-coil domains. This framework can be adapted for globular proteins or extended to incorporate a variety of high-throughput techniques.
Abstract
Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are found throughout nature, however, because of their physical properties and tendency to aggregate, they are traditionally viewed as being especially difficult to crystallize. Here, we utilize a variety of quick and simple techniques designed to identify a series of possible domain boundaries for a given coiled-coil protein, and then quickly characterize the behavior of these proteins in solution. With the addition of a strongly fluorescent tag (mRuby2), protein characterization is simple and straightforward. The target protein can be readily visualized under normal lighting and can be quantified with the use of an appropriate imager. The goal is to quickly identify candidates that can be removed from the crystallization pipeline because they are unlikely to succeed, affording more time for the best candidates and fewer funds expended on proteins that do not produce crystals. This process can be iterated to incorporate information gained from initial screening efforts, can be adapted for high-throughput expression and purification procedures, and is augmented by robotic screening for crystallization.
Introduction
determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X ha dato un contributo fondamentale a tutti i campi della biologia moderna; fornendo una vista atomico delle macromolecole che sostengono la vita e come interagiscono tra loro in una varietà di contesti; che ci permette di comprendere i meccanismi che causano la malattia e che offrono opportunità di progettare razionalmente farmaci per il trattamento della malattia. Cristallografia è stata a lungo la tecnica sperimentale dominante per determinare la struttura macromolecolare, che rappresentano attualmente il 89,3% della base di dati strutturale (www.rcsb.org). Questa tecnica ha molti vantaggi, compreso il potenziale molto alta risoluzione, la capacità di visualizzare macromolecole con una vasta gamma di dimensioni, di relativamente facile raccolta dei dati, e la possibilità di visualizzare come macromolecola interagisce con solventi e leganti.
Nonostante i numerosi miglioramenti tecnologici nel espressione della proteina ricombinante 1,2, purification 3, e della biologia molecolare utilizzato per generare questi sistemi 4, il vero grande ostacolo nel processo cristallografica rimane la capacità di crescere cristalli di qualità diffrazione. Questo è stato particolarmente vero per le proteine che contengono domini di grandi dimensioni avvolto a spirale. E 'stato stimato che ben il 5% di tutti gli aminoacidi si trovano all'interno di bobine a spirale 5,6, rendendo questa una caratteristica strutturale molto comune 7, eppure queste proteine sono spesso più difficili da purificare e cristallizzare di proteine globulari 8-10 . Questo è ulteriormente aggravato dal fatto che i domini coiled-coil trovano spesso nel contesto di una proteina più grande, quindi prevedere correttamente i confini di questi domini è fondamentale per evitare l'inclusione di sequenza non strutturata o flessibile che spesso è dannosa per la cristallizzazione.
Qui vi presentiamo un quadro concettuale che unisce web-based computazionale analisi con Experimental dati dalla panchina, per aiutare gli utenti di guida attraverso le fasi iniziali del processo cristallografica, tra cui: Come selezionare frammento di proteina (s) per studi strutturali, e come preparare e caratterizzare campioni di proteine prima di tentativi di cristallizzazione. Ci concentriamo la nostra analisi su due proteine contenenti domini di grandi dimensioni avvolto a spirale, Shroom (SHRM) e Rho-chinasi (Rock). Queste proteine sono stati scelti come entrambi contengono domini coiled-coil e sono noti per formare un complesso biologicamente rilevante 11-16. Shroom e Rho-chinasi (Rock) sono previsti per contenere rispettivamente ~ 200 e 680 residui di avvolto a spirale, molte parti della quale sono state caratterizzate strutturalmente 17-20. Il metodo qui descritto fornisce un flusso di lavoro per identificare rapidamente frammenti di coiled-coil contenenti proteine che saranno suscettibili per la cristallizzazione, tuttavia, le tecniche descritte possono essere facilmente adattati per la maggior parte della proteina o proteina complessi o modificati per incorporare high-throughput avvicinamenches come disponibili. Infine, questi metodi sono generalmente poco costosi e possono essere eseguite dagli utenti a quasi tutti i livelli di esperienza.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto è stato progettato per aiutare l'utente a identificare i confini del dominio all'interno di grandi proteine avvolto a spirale per facilitare la loro cristallizzazione. Il protocollo si basa su una incorporazione olistica di una varietà di dati da predizioni computazionali ed altre fonti per generare una serie di potenziali dominio confini. Seguono una serie di esperimenti biochimici che sono veloce e poco costoso, e che sono utilizzati per raffinare ulteriormente queste ipotes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grant NIH R01 GM097204 (APV and JDH). Funding for JHM was supplied by an HHMI Undergraduate Research Summer Fellowship.
Materials
| BL21(DE3) Rosetta | Emd Millipore | 70954-3 | |
| BL21(DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | |
| BL21(DE3) Codon Plus | Agilent Technologies | 230245 | |
| Lysozyme | Spectrum Chemical Mfg Corp | L3008-5GM | |
| Ni-NTA resin | Life Technologies | 25216 | |
| SubtilisinA | Spectrum Chemical Mfg Corp | S1211-10ML | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-160 | |
| INTELLI-PLATE 96: | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
| PEG 3350 | Hampton research | HR2-591 | |
| PEG 8000 | Hampton research | HR2-515 | |
| PEG 400 | Hampton research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton research | HR2-605 | |
| pcDNA3.1-Clover-mRuby2 | Addgene | 49089 | |
| Overnight Express Autoinduction System 1 | Emd Millipore | 71300 | |
| Lysogeny Broth powder | ThermoFisher Scientific | 12795027 |
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