A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.
Традиционные меры внутриклеточного антимикробной активности и эукариотических клеток цитотоксичности полагаются на конечных анализов. Такие конечные точки анализы требуют несколько дополнительных экспериментальных шагов до начала считывания, такие как лизис клеток, определение элементарной колониеобразующих или добавления реагента. При выполнении тысячи анализов, например, во время высокопроизводительного скрининга, усилие вниз по течению, необходимое для этих типов анализов значительна. Поэтому, чтобы облегчить высокую пропускную способность противомикробное открытие, мы разработали анализ в режиме реального времени для одновременного идентификации ингибиторов внутриклеточного роста бактерий и оценки эукариотической клетки цитотоксичность. В частности, обнаружение внутриклеточный рост бактерий в режиме реального времени стало возможным благодаря маркировке бактериальных штаммов скрининга либо с бактериальным лк оперона (1 – е поколение) для анализа или флуоресцентный белок репортеров (2 – го поколения, ортогональным анализ). Нетоксичное, клеточная мембрана-impermeant, кислотно-связывающий краситель нуклеиновойТакже была добавлена во время первичного инфицирования макрофагов. Эти красители исключаются из жизнеспособных клеток. Тем не менее, нежизнеспособные клетки-хозяева теряют целостность мембраны, разрешающий вход и флуоресцентного мечения ядерной ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты). Следует отметить, что связывание с ДНК связано с большим увеличением флуоресцентного квантовым выходом, который обеспечивает считывание решение на основе гибели клетки-хозяина. Мы использовали этот комбинированный анализ для выполнения экран высокой пропускной способностью в формате микропланшетов, а также для оценки внутриклеточного роста и цитотоксичности с помощью микроскопии. Следует отметить, что противомикробные может демонстрировать синергизм в которых комбинированное действие двух или более антимикробных при применении вместе больше, чем при применении по отдельности. Тестирование на синергии в пробирке против внутриклеточных патогенов , как правило, чудовищный задача , как должна быть оценена комбинаторные перестановками антибиотиков при различных концентрациях. Тем не менее, мы обнаружили, что наши в режиме реального времени анализа в сочетании с автоматизированной, цифровой технологии раздаточного рermitted легкое тестирование синергии. Используя эти подходы, мы были в состоянии систематически обследовать действие большого числа одних антимикробных и в сочетании с внутриклеточным патогеном, легионелл.
Возбудители, которые растут или временно проживают в внутриклеточным трудно терапевтически искоренить. Облигатные или относительно облигатные внутриклеточные патогены , такие как легионелл, Coxiella burnetii, Brucella SPP. , Francisella tularensis и Mycobacterium SPP. часто требуют длительного курса антибактериальной терапии для лечения, которые могут варьироваться от нескольких месяцев до даже лет. Кроме того, внеклеточные патогены могут скоротечно занимают внутриклеточные ниши и таким образом избежать зазора обычными курсами антибактериальной терапии, а затем появляются, чтобы начать новые раунды вирулентных инфекции. Золотистый стафилококк 1 и уропатогенные Enterobacteriaceae 2,3 инфекции два все чаще признаются примеры. Таким образом, основной целью обнаружения наркотиков является выявление новых противомикробных препаратов, которые проникают во внутриклеточные отсеки. Оптимальная терапия быстро ликвидироватьвнутриклеточные микроорганизмы и предотвратить развитие резистентности через суб-ингибиторной антимикробного воздействия особенно желательно.
С этой целью мы разработали технологию высокопроизводительного скрининга для выявления внутриклеточных-пенетранта противомикробные препараты , нацеленные на внутриклеточный рост модели патогена, легионелл. 4 Предыдущие клинические наблюдения указывают на то, что стандартное тестирование чувствительность к антибиотикам не точно предсказать , в естественных условиях терапевтической эффективности против этого организма. 5 В частности, это произошло потому , что основные классы противомикробных , таких как бета-лактамов и аминогликозидов, хотя они весьма эффективны против axenically выращенного Legionella, не в достаточной степени проникают в внутриклеточные отсеки , где Legionella проживает. 5,6 Впоследствии данные свидетельствуют о том, что технически более сложные анализы внутриклеточного роста эффективно предсказали клиническую эффективность. 7 </sup> К сожалению, эти анализы были чрезвычайно трудоемкие анализы конечных точек, требующих зараженных макрофаги, противомикробные препараты, чтобы быть лизируют в разное время точек для колониеобразующих единицы перечисления. Такие анализы являются непрактичными делать в больших масштабах и непригодны для обнаружения наркотиков с высокой пропускной способностью.
Таким образом, мы разработали технологию для определения в реальном времени внутриклеточного роста бактерий. 6 Это было достигнуто за счет использования бактериального штамма модифицированного путем интеграции либо бактериальной люциферазы оперон 8 (проба первого поколения, описанный ранее) 4 или флуоресцентный белок 9 репортеров (второго поколения, ортогональный анализе описано здесь) в бактериальную хромосому. Таким образом, люминесцентный или флуоресцентный сигнал обеспечивает заменяющим, в режиме реального времени отсчет бактериального числа.
Тем не менее, эти атрибуты не затрагивают основную confounder внутриклеточного infectioп анализы, вне цели воздействия на клетки-хозяева. В частности, гибель клетки-хозяина по своей сути ограничивает внутриклеточный рост и приводит к ложной положительной идентификации антимикробного эффекта. Поскольку многие соединения в библиотеках скрининга являются эукариотической клетки токсические, такие ложные срабатывания будут подавлять истинные противомикробные средства, что требует большого количества наблюдения, конечная точка цитотоксичности для разрешения.
Таким образом, это был большой интерес, чтобы быть в состоянии оценить жизнеспособность клеток эукариот и внутриклеточный рост одновременно. Следует отметить, что характеристика нежизнеспособных эукариотических клеток является потеря целостности клеточных мембран. Поэтому Зонды, которые проверяют проницаемость клеточной мембраны, могут быть использованы для оценки жизнеспособности клеток. Ранее мы охарактеризовали способность ряда предполагаемо клеточных мембран-impermeant, флуоресцентный, ДНК-связывающих красителей для доступа и окрашивает ядерную ДНК мертвых клеток. 4 При связывании ядерную ДНК, эти красители показывать значительное увеличение quantuм флуоресцентный выход приводит к увеличению сигнала над фоном раствора флуоресценции. Таким образом, эти красители при условии количественного считывания эукариотической клеточной гибели. 4 Следует отметить, что мы обнаружили , что некоторые были не токсичны сами по себе в течение длительного совместной инкубации с J774 макрофагами. При добавлении во время первичной инфекции, они обеспечили в режиме реального времени, флуоресцентный отсчет эукариотической клеточной смерти, которая может быть измерена с помощью микропланшет флуориметре или наблюдаемую микроскопически.
Таким образом, путем объединения использование бактериального репортера и нетоксичного, мембранная-impermeant, ДНК-связывающие красители, мы смогли разработать простой, неразрушающий, в режиме реального времени анализа для измерения как бактериальной нагрузки и эукариотической клетки цитотоксичность одновременно. Этот анализ позволил нам экран в 384-луночного формата пластины ~ 10000 известных биоактивных включая ~ 250 антимикробные и> 240000 малые молекулы с функционально неохарактеризованной активностью по способности ингибировать внутриклеточный ростЛегионелл, в то же время при создании эукариотических данных цитотоксичности для каждого соединения. 6 Наш анализ известных антимикробных против внутриклеточного роста легионелл был наиболее полное исследование этого типа на сегодняшний день. 6
На основе эффективности нашего формате анализа, мы также исследовали в дальнейшем потенциально синергетические эффекты известных антимикробных при использовании в комбинации. Одним из наиболее распространенных тестов синергии, так называемый шахматный анализ, Стандартно выполняется путем оценки комбинаторных эффектов двукратными серийными разведениями двух или более противомикробных препаратов. 10 В этих анализах, синергизм определяется наблюдением большего эффекта , когда два или более противомикробные препараты применяются вместе , чем сумма эффектов каждого применяемого отдельно. Следует отметить, что до сих пор, только целенаправленным и селективным тестирование синергии проводили против внутриклеточных легионелл </eм> из-за больших усилий, участвующих в традиционных конечных точек анализов, умноженное на комбинаторных перестановок требуется.
Для облегчения тестирования синергии, мы использовали наш реального времени внутриклеточного роста / эукариотической анализа на цитотоксичность в сочетании с автоматизированной цифровой технологией раздаточного 6. Это автоматизации позволило нам обойтись серийных разведений соединений, растворенных в диметилсульфоксиде или в отдельности или в комбинации в виде 384-водного раствора. 11 Кроме того, такая надежная технология жидкости обработка позволила нам легко выполнять более высокое разрешение, квадратного корня из двух (а не стандарт, более низкое разрешение, удвоение) комбинации разбавления для достижения более высоких уровней специфичности в нашем двумерная, в шахматном порядке синергии анализ. Это разрешение было особенно ценно в решении проблем в области синергии о воспроизводимости при использовании двукратном разбавлении серии 12. И, наконец, наш анализ был количественным, а также TherEfore измеряется градаций торможения. В результате, анализ захватили полноту ингибиторной информации, экспрессируемый в isocontour isobolograms, в котором isocontours соединить комбинаторные концентрации с аналогичными уровнями ингибирования роста. 6 Эта стратегия позволила визуализировать построение комбинаторных кривых доза-ответ. Чтобы проиллюстрировать нашу методологию, мы описываем наш протокол для выполнения этих анализов и показывают репрезентативные результаты.
Мы описываем анализы в режиме реального времени для одновременного обнаружения внутриклеточного роста бактерий и клетки-хозяина цитотоксичности. Есть несколько важных шагов в протоколе. Во-первых, для надежного проведения анализа, должно быть достаточным, спектральное разделение ме…
The authors have nothing to disclose.
Исследования сообщили в этой рукописи была поддержана Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний Национального института здоровья под номером награду R01AI099122 к JEK Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института Здоровье. Мы хотели бы поблагодарить Дженнифер Смит, Дэвид Wrobel, Су Чан, Даг Flood, Шон Джонстон, Дженнифер Nale, Стюарт Рудницкий, Пол Ян, Ричард С.Ю., и Рэйчел Стража из Screening фонда ICCB-Longwood и / или национальной лаборатории скрининга для Новой Англии региональных центров передового опыта в Biodefense и вновь возникающих инфекционных болезней (при поддержке U54AI057159) за их помощь в разработке и выполнении скрининговых исследований с высокой пропускной способностью. Мы также хотели бы поблагодарить Кеннет П. Смита за полезные замечания по рукописи.
J774A.1 cells | American Type Culture Collection | TIB-67 | Host cell |
ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
Yeast extract, ultrafiltered | Becton-Dickinson/Difco | 210929 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors |
Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt | Sigma-Aldrich | K2000 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
Potassium phosphate, dibasic | Thermo Fisher Scientific | P288-500 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
L-cysteine | Sigma-Aldrich | C-7755 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
Ammonium iron(III) citrate | Sigma-Aldrich | F5879 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately |
Potassium hydroxide solution, concentrated | Thermo Fisher Scientific | SP236-500 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
Deonized water | N/A | N/A | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
Thymidine (tissue culture grade) | Sigma-Aldrich | T1895 | For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640 |
RPMI 1640, standard formulation | Corning via Thermo Fisher Scientific | 10-040-CV | For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine |
RPMI 1640 lacking phenol red | Corning via Thermo Fisher Scientific | 17-105-CV | For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use |
L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade) | HyClone via Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration |
Iron-supplemented calf serum | Gemini Bioproducts | 100-510 | For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration |
Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density |
SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S7020 | For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration. |
GelRed, 10000X solution in water | Biotium | 41003 | For staining for J774A.1 cell death determination by epifluorescence microscopy (in conjunction with green fluorescent bacteria). Use Gel Red at 1X final concentration. |
Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-255-26 | For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead) |
Orbital shaker | BellCo Glass | 7744-01010 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately) |
Shaker flasks (250 ml) | ChemGlass Life Sciences | CLS-2038-04 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
Shaker clamps for flasks (250 ml) | BellCo Glass | 7744-16250 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
Shaker flasks (1000 ml) | ChemGlass Life Sciences | CLS-2038-07 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
Shaker clamps for flasks (1000 ml) | BellCo Glass | 7744-16100 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
Sponge foam caps for flasks (250 ml – 1000 ml) | ChemGlass Life Sciences | CLS-1490-038 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps |
MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes |
Combi standard bore manifold | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | Default predispense volume of 20 ml is insufficient to compensate for settling — increase to 80 ml |
White 384 well dishes treated for tissue culture | Corning | 3570 | For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully |
DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules) | Sigma-Aldrich | D2650 | For dissolving positive control and test compounds |
Azithromycin | Sigma-Aldrich | PHR1088 | Antibiotic positive control |
Saponin (from Quillaja bark) | Sigma-Aldrich | S-4521 | Cytoxicity positive control |
Multichannel pipettor | Thermo Fisher Scientific | Finnpipette | For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing |
Epson pin transfer robot | Epson/ICCB-L | (Custom equipment) | For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays |
D300 digital dispensing system | Hewlett-Packard via Tecan | D300 | For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 microliters |
T8+ cartridges for D300 digital dispensing system | Hewlett-Packard via Tecan | T8+ | For dispensing test compounds |
EnVision multi-mode plate reader | Perkin-Elmer | (Contact manufacturer) | For optimal detection of SYTOX Green fluorescence, use excitation filter 485/14, emission filter 535/25, and dichroic mirror 505 nm, with selection of minimum gain and transmittance, and “high concentration mode. For luminescence detection, use the "USLUM" protocol for high-sensitivity detection. For mNeptune2 detection, use excitation filter 600/8, emission filter 665/7.5, and dichroic mirror 658 nm, with selection of gain and transmittance to achieve the highest maximum signal possible without saturating the photomultiplier. |
Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera | Nikon | Ti | For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution |
Glass-bottom tissue culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope. These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms. |
Photoshop CS6 | Adobe | Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images. | |
Mathematica 10 | Wolfam | For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms. |