Summary

תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים

Published: November 16, 2016
doi:

Summary

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Abstract

מדדים מסורתיים של פעילות מיקרוביאלית תאיים cytotoxicity תא אוקריוטים להסתמך על מבחני הסיום. מבחני הסיום כאלה דורשים כמה צעדים ניסיוניים נוספים לפני readout, כגון תמוגה התא, נחישות יחידת המושבה להרכיב, או בנוסף מגיב. בעת ביצוע אלף מבחנים, למשל, במהלך הקרנת תפוקה גבוהה, המאמץ במורד הזרם הנדרש עבור סוגים אלה של מבחנים הוא ניכר. לכן, כדי להקל על גילוי מיקרוביאלית תפוקה גבוה, פתחנו assay בזמן אמת לזהות מעכבים הזמניים של התפתחות חיידקים תאית ולהעריך cytotoxicity תא האיקריוטים. באופן ספציפי, זיהוי התפתחות חיידקים תאית בזמן האמת היה מופעל על ידי סימון זני הקרנה חיידקי גם עם אופרון לוקס בקטריאלי (1 assay דור st) או כתבי חלבון פלואורסצנטי (2 דור nd, assay המאונך). לצבוע רעיל, קרום התא-impermeant, חומצות גרעין מחייבגם נוסף במהלך הדבקה ראשונית של מקרופאגים. צבעים אלה אינם נכללים תאי קיימא. עם זאת, תאי מארחים לא-ישימים לאבד שלמות קרום המתיר כניסה וסימון ניאון של DNA הגרעיני (חומצת deoxyribonucleic). יש לציין, DNA כריכה קשור לעלייה גדולה תשואת קוונטים פלורסנט המספקת הודעת פתרון המבוסס על מות תא מארח. השתמשנו assay המשולב הזה לבצע מסך תפוקה גבוהה בפורמט microplate, ועל מנת להעריך את הצמיחה ואת cytotoxicity תאיים על ידי מיקרוסקופ. יש לציין, antimicrobials עשוי להפגין סינרגיה שבו ההשפעה המשולבת של שתיים או יותר antimicrobials כאשר מיושמים יחד עולה כאשר מיושמים בנפרד. בדיקת לסינרגיה במבחנה נגד פתוגנים תאיים היא בדרך כלל משימה אדירה כמו פרמוטציות קומבינטורית של אנטיביוטיקה בריכוזים שונים צריך להיבדק. עם זאת, מצאנו כי assay בזמן האמת שלנו בשילוב עם אוטומטיות, דיגיטלי מחלק הטכנולוגיה permitted בדיקות סינרגיה קליל. באמצעות גישות אלו, הצלחנו לסקור פעולה שיטתית של מספר רב של antimicrobials לבד או ביחד נגד הפתוגן התאי, pneumophila הלגיונלה.

Introduction

פתוגנים גדלים או מתגוררים באופן זמני בתאים תאיים קשים למגר טיפולי. לחייב או יחסית לחייב פתוגנים תאיים כגון pneumophila הלגיונלה, burnetii Coxiella, spp Brucella. Francisella, tularensis, ו spp Mycobacterium. לעתים קרובות דורשים ממושך קורסים של טיפול אנטי-מיקרוביאלי לריפוי כי עשוי לנוע בין חודשים ואף שנים. יתר על כן, פתוגנים תאיים עשויים זמני לכבוש נישות תאיות בדרך זו לברוח אישור על ידי קורסים רגילים של טיפול אנטי-מיקרוביאלי, ואחר כך יוצא להתחיל סיבובים חדשים של זיהום ארסי. Staphylococcus aureus 1 וזיהומי uropathogenic 2,3 Enterobacteriaceae הם שתי דוגמאות להכרה גוברת. לכן, מטרת גילוי תרופות בסיסית היא לזהות antimicrobials רומן חודרים לתאים תאיים. טיפול אופטימלי במהירות לבעראורגניזמים תאיים ולמנוע התפתחות של עמידות באמצעות חשיפה מיקרוביאלית תת-מעכבות במיוחד רצוי.

לשם כך, פתחנו טכנולוגית הקרנת תפוקה גבוהה לזהות antimicrobials תאי-penetrant מיקוד הצמיחה התאית של הפתוגן המודל, pneumophila הלגיונלה. 4 תצפיות קליניות קודמות עולות כי בדיקות רגישות מיקרוביאלית תקן לא לחזות במדויק יעילות טיפולית vivo נגד אורגניזם זה. באופן ספציפי 5, זה היה בגלל סוגים עיקריים של antimicrobials כמו β-lactams ו אמינוגליקוזידים, למרות יעיל מאוד נגד axenically גדלה הלגיונלה, אינם חודרים מספיק לתוך התאים התאיים שבו הלגיונלה מתגורר. 5,6 ראיות בהמשך הציעו טכני מורכבים יותר מבחני צמיחה תאית חזה יעילות קלינית ביעילות. 7 </sup> למרבה הצער, אלה מבחנים היו מבחני נקודות קצה מייגעים, מחייב מקרופאגים נגועים, שטופלו antimicrobials, להיות lysed בנקודות בזמנים שונים עבור ספירת יחידת מושבה להרכיב. מבחנים כאלה הם מעשי לעשות בקנה מידה גדולה והם מתאימים לגילוי סמי תפוקה גבוהה.

לכן, פתחנו טכנולוגיה לקביעה בזמן האמת של התפתחות חיידקים תאית. 6 הדבר זה הושג באמצעות שימוש זן חיידקים השונה באמצעות שילוב של אחת המעמד של חיידקים בלוציפראז אופרון 8 (assay הדור הראשון, שתואר לעיל) 4 או פלורסנט חלבון 9 עיתונאים (דור שני, assay המאונך, המתוארת כאן) לתוך כרומוזום החיידקים. בדרך זו, זורח או אות ניאון מספק פונדקאית, readout בזמן אמת של מספר חיידקים.

עם זאת, תכונות אלה לא להתייחס מתערבים מרכזיים infectio התאימבחני n, השפעות חוץ-היעד בתא הפונדקאי. בפרט, מותו של תא המארח מגביל מטבעו צמיחה תאית וגורם זיהוי חיובי כוזב של אפקט מיקרוביאלית. כמו תרכובות רבות בספריות הקרנה הן תאים איקריוטיים, רעילות תוצאות חיוביות שגויות כאלה היו להציף antimicrobials נכון, דבר מחייב מספר גדול של מעקב, מבחני cytotoxicity קץ לשם קבלת החלטה.

לכן, זה היה עניין רב כדי להיות מסוגל להעריך כדאיויות תא האיקריוטים וצמיחה תאית זמנית. יש לציין, מאפיין של תאים איקריוטיים הלא קיימא הוא הפגיעה בשלמות קרום התא. בדיקות הבודקים את החדירות של קרום התא עשוי אפוא לשמש כדי להעריך כדאיות התא. אנחנו שאפיינו את היכולת של סדרת-impermeant קרום התא putatively, ניאון, צבעים-DNA מחייבת לגשת להכתים DNA הגרעיני של תאים מתים. 4 ביום ה- DNA מחייב גרעינית, צבעים אלה מהווים גידול גדול quantuמ פלורסנט תשואה וכתוצאה מכך האות מוגברת על קרינת פתרון רקע. ככזה, צבעים אלה ספקו הודעה כמותי של מוות של תאים איקריוטיים. 4 יש לציין, מצאנו כי כמה היו רעילים עצמם במהלך שיתוף דגירה ממושכת עם מקרופאגים J774. כאשר נוספו במהלך הזיהום הראשוני, הם סיפקו בזמן אמת, ההודעה ניאון של מוות של תאים איקריוטיים שניתן למדוד על ידי fluorimeter microplate או שנצפה מיקרוסקופית.

לכן, על ידי שילוב של השימוש עיתונאי חיידקים ולא רעיל, קרום impermeant, צבעי ה- DNA מחייב, הצלחנו לפתח assay פשוט, שאינו הרסני, בזמן אמת כדי למדוד הן עומס חיידקים ו cytotoxicity תא אוקריוטים זמנית. assay זו אפשרה לנו להקרין בפורמט צלחת 384 גם ~ 10,000 bioactives ידוע כולל ~ 250 antimicrobials ו> 240,000 מולקולות קטנות עם פעילות uncharacterized מבחינה תפקודית עבור היכולת לעכב צמיחה תאית שלPneumophila הלגיונלה, בעוד באותו הזמן להפקת נתוני cytotoxicity התא אוקריוטים לכל מתחם. 6 הניתוח שלנו של antimicrobials הידוע מפני צמיחה תאית של הלגיונלה היה החקר המקיף ביותר מסוג זה עד כה. 6

בהתבסס על היעילות של פורמט assay שלנו, אנו ובהמשך גם בחנו את ההשפעות סינרגיסטי הפוטנציאלי של antimicrobials ידוע מתי להשתמש בשילוב. אחד המבחנים סינרגיה הנפוצים ביותר, assay שחמט שנקרא, מבוצע standardly ידי הערכת ההשפעות קומבינטורית של דילולים סדרתי כפולה של שניים או יותר antimicrobials. 10 מבחנים אלה, סינרגיה מוגדרת על ידי התצפית של השפעה גדולה יותר כאשר שתיים או יותר antimicrobials מוחלים יחד מסכום ההשפעות של כל מיושמות בנפרד. מן ראוי לציין כי, עד כה, התמקד רק ובדיקת סינרגיה סלקטיבית בוצעה נגד pneumophila הלגיונלה התאי </em> בגלל מאמץ הרב טמון מבחני סיום מסורתיים מוכפלים פרמוטציות קומבינטורית הנדרשת.

כדי לאפשר בדיקת סינרגיה, עשינו שימוש הצמיחה תאית בזמן האמת שלנו / assay cytotoxicity איקריוטיים בשילוב עם טכנולוגיה מחלק דיגיטלית אוטומטית 6. אוטומציה זה מותר לנו לוותר דילולי סדרה של תרכובות המומסות DMSO או בתמיסה מימית לבד או בשילוב בפורמט 384 גם. 11 יתר על כן, טכנולוגית טיפול נוזל חזקה כאלה מותר לנו לבצע ברזולוציה גבוהה יותר בקלות, שורש ריבועי-של-שני (ולא סטנדרטי, רזולוציה נמוכה יותר, הכפלה) שילובי דילול להשיג רמות גבוהות יותר של סגוליות בסינרגיה דו הממדים, שחמט שלנו אָנָלִיזָה. החלטה זו הייתה יקרה במיוחד מענה לחששות בתחום סינרגיה על שחזור בעת שימוש סדרת דילול הכפול 12. לבסוף, assay שלנו הוא כמותי וגם יסefore נמדד דרגות של עיכוב. כתוצאה מכך, assay כבש את מכלול המידע מעכב, שבא לידי ביטוי isobolograms isocontour שבו isocontours להתחבר ריכוזים קומבינטורית עם רמות דומות של עיכוב צמיחה. 6 זה אסטרטגיה והתוויית מותרת להדמיה של עקומות קומבינטורית מנה-תגובה. כדי להמחיש המתודולוגיה שלנו, אנו מתארים הפרוטוקול שלנו לביצוע מבחנים אלה ולהציג תוצאות נציג.

Protocol

1. צמיחה התאית Real Time ו Assay Cytotoxicity Cell איקריוטיים תאי מארח הכנה (תאי J774A.1) תרבות J774A.1 תאי מקרופאג דמוי musculus Mus ההשעיה ב RPMI 1640 עם 9% נסיוב עגל-בתוספת ברזל. בתחילה מעבר צלוחי?…

Representative Results

assay צמיחה התאי microplate איור 1 דיאגרמות הצעדים assay. השלבים האוטומטיים לראות יכולים להתבצע באופן ידני. עם זאת, התפוקה היא הקל מאוד באמצעות מערכות טיפול נוזליות. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-…

Discussion

אנו מתארים מבחנים בזמן אמת עבור זיהוי סימולטני של התפתחות חיידקים תאית cytotoxicity תא מארח. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, עבור ביצועים assay חזקים, חייבת להיעשות הפרדה ספקטרלי מספיק בין readouts חיידקים cytotoxicity. הפרדה כזו היא חלק מובנה עבור שילובים של כתבים אופרון בל?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר דיווח בכתב היד הזה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספר פרסי R01AI099122 כדי JEK התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי בְּרִיאוּת. ברצוננו להודות ג'ניפר סמית, הדוד וורובל, סו צ'יאנג, דאג מבול, שון ג'ונסטון, ג'ניפר רציונל, סטיוארט רודניצקי, פול יאן, ריצ'רד סיו, ורחל וורדן ממתקן הקרנת ICCB-Longwood ו / או מעבדת ההקרנה הארצית המרכזים האזוריים של ניו אינגלנד מצוינת להגנה מפני טרור ביולוגי ומתפתחים מחלות זיהומיות (נתמכות על ידי U54AI057159) על עזרת פיתוח וביצוע מבחני תפוקה גבוהה הקרנה. כמו כן, אנו רוצים להודות קנת פ סמית על הערות מועילות על כתב היד.

Materials

J774A.1 cells American Type Culture Collection TIB-67 Host cell
ACES Sigma-Aldrich A9758  For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Yeast extract, ultrafiltered Becton-Dickinson/Difco 210929 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors
Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt Sigma-Aldrich K2000 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Potassium phosphate, dibasic Thermo Fisher Scientific P288-500 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
L-cysteine Sigma-Aldrich C-7755 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Ammonium iron(III) citrate Sigma-Aldrich F5879 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately
Potassium hydroxide solution, concentrated Thermo Fisher Scientific SP236-500 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Deonized water N/A N/A For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Thymidine (tissue culture grade) Sigma-Aldrich T1895 For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640
RPMI 1640, standard formulation Corning via Thermo Fisher Scientific 10-040-CV For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine
RPMI 1640 lacking phenol red Corning via Thermo Fisher Scientific 17-105-CV For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use
L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade) HyClone via Thermo Fisher Scientific SH30034.02 For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration
Iron-supplemented calf serum Gemini Bioproducts 100-510 For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154 For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density
SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO Thermo Fisher Scientific S7020 For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration.
GelRed, 10000X solution in water Biotium 41003 For staining for J774A.1 cell death determination by epifluorescence microscopy (in conjunction with green fluorescent bacteria). Use Gel Red  at 1X final concentration.  
Cell culture incubator Thermo Fisher Scientific 13-255-26 For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead)
Orbital shaker BellCo Glass 7744-01010 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately)
Shaker flasks (250 ml) ChemGlass Life Sciences CLS-2038-04 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (250 ml) BellCo Glass 7744-16250 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker flasks (1000 ml) ChemGlass Life Sciences CLS-2038-07 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (1000 ml) BellCo Glass 7744-16100 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Sponge foam caps for flasks (250 ml – 1000 ml) ChemGlass Life Sciences CLS-1490-038 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps
MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump Thermo Fisher Scientific 5840300 For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes
Combi standard bore manifold Thermo Fisher Scientific 24072670 Default predispense volume of 20 ml is insufficient to compensate for settling — increase to 80 ml
White 384 well dishes treated for tissue culture Corning 3570 For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully
DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules) Sigma-Aldrich D2650 For dissolving positive control and test compounds
Azithromycin Sigma-Aldrich PHR1088 Antibiotic positive control
Saponin (from Quillaja bark) Sigma-Aldrich S-4521 Cytoxicity positive control
Multichannel pipettor Thermo Fisher Scientific Finnpipette For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing
Epson pin transfer robot Epson/ICCB-L (Custom equipment) For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays
 D300 digital dispensing system Hewlett-Packard via Tecan D300 For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 microliters
T8+ cartridges for D300 digital dispensing system Hewlett-Packard via Tecan T8+ For dispensing test compounds
EnVision multi-mode plate reader Perkin-Elmer (Contact manufacturer) For optimal detection of SYTOX Green fluorescence, use excitation filter 485/14, emission filter 535/25, and dichroic mirror 505 nm, with selection of minimum gain and transmittance, and “high concentration mode. For luminescence detection, use the "USLUM" protocol for high-sensitivity detection. For mNeptune2 detection, use excitation filter 600/8, emission filter 665/7.5, and dichroic mirror 658 nm, with selection of gain and transmittance to achieve the highest maximum signal possible without saturating the photomultiplier.
Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera Nikon Ti For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution
Glass-bottom tissue culture dishes MatTek Corporation P35G-1.5-20-C For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope.  These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms.
Photoshop CS6 Adobe Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images.
Mathematica 10 Wolfam For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms.

References

  1. Garzoni, C., Kelley, W. L. Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistence. Trends Microbiol. 17 (2), 59-65 (2009).
  2. Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infect Immun. 76 (7), 3337-3345 (2008).
  3. Blango, M. G., Mulvey, M. A. Persistence of uropathogenic Escherichia coli in the face of multiple antibiotics. Antimicrob Agents Chemother. 54 (5), 1855-1863 (2010).
  4. Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 219-228 (2014).
  5. Edelstein, P. H. Antimicrobial chemotherapy for legionnaires’ disease: a review. Clin Infect Dis. 21 Suppl 3, S265-S276 (1995).
  6. Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. High-Throughput Intracellular Antimicrobial Susceptibility Testing of Legionella pneumophila. Antimicrob Agents Chemother. 59 (12), 7517-7529 (2015).
  7. Pedro-Botet, L., Yu, V. L. Legionella: macrolides or quinolones?. Clin Microbiol Infect. 12 Suppl 3, 25-30 (2006).
  8. Coers, J., Vance, R. E., Fontana, M. F., Dietrich, W. F. Restriction of Legionella pneumophila growth in macrophages requires the concerted action of cytokine and Naip5/Ipaf signalling pathways. Cell Microbiol. 9 (10), 2344-2357 (2007).
  9. Chu, J., et al. Non-invasive intravital imaging of cellular differentiation with a bright red-excitable fluorescent protein. Nat Methods. 11 (5), 572-578 (2014).
  10. Eliopoulos, G. M., Moellering, R. C., Lorian, V. Ch. 9. Antimicrobial combinations. In: Antibiotics in Laboratory Medicin. , 330-396 (1996).
  11. Jones, R. E., Zheng, W., McKew, J. C., Chen, C. Z. An alternative direct compound dispensing method using the HP D300 digital dispenser. J Lab Autom. 18 (5), 367-374 (2013).
  12. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. J Antimicrob Chemother. 52 (1), (2003).
  13. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  14. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
  15. Berger, K. H., Merriam, J. J., Isberg, R. R. Altered intracellular targeting properties associated with mutations in the Legionella pneumophila dotA gene. Mol Microbiol. 14 (4), 809-822 (1994).
  16. Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol Microbiol. 7 (1), 7-19 (1993).
  17. Vogel, J. P., Isberg, R. R. Cell biology of Legionella pneumophila. Curr Opin Microbiol. 2 (1), 30-34 (1999).
  18. Kirby, J. E., Isberg, R. R. Legionnaires’ disease: the pore macrophage and the legion of terror within. Trends Microbiol. 6 (7), 256-258 (1998).
  19. Kirby, J. E., Vogel, J. P., Andrews, H. L., Isberg, R. R. Evidence for pore-forming ability by Legionella pneumophila. Mol Microbiol. 27 (2), 323-336 (1998).
  20. Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279 (5352), 873-876 (1998).
  21. Song, H., Fares, M., Maguire, K. R., Sidén, A., Potácová, Z. Cytotoxic Effects of Tetracycline Analogues (Doxycycline, Minocycline and COL-3) in Acute Myeloid Leukemia HL-60 Cells. PLoS ONE. 9 (12), e114457 (2014).
  22. Isberg, R. R., Falkow, S. A single genetic locus encoded by Yersinia pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12. Nature. 317 (6034), 262-264 (1985).
  23. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development. Expert Opin Drug Discov. 3 (6), 655-669 (2008).
  24. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr Chem Genomics. 3, 33-41 (2009).
  25. Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 9 (5), 580-588 (2009).
  26. Dunlap, P., Thouand, G., Marks, R. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. Bioluminescence: Fundamentals and Applications in Biotechnology – Volume 1. 1, 37-64 (2014).

Play Video

Cite This Article
Chiaraviglio, L., Kang, Y., Kirby, J. E. High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity. J. Vis. Exp. (117), e54841, doi:10.3791/54841 (2016).

View Video