Ein Fluoreszenz-basierte Assay von Phospholipid Scramblase Activity

Der Photorezeptor Rhodopsin, eine prototypische G – Protein-gekoppelten Rezeptor (beispielsweise in Bezug Bewertung ¹⁾ ist das erste Phospholipid scramblase werden identifiziert und biochemisch verifiziert ^2,3. Scramblases sind Phospholipid – Transporter, die die eigen langsamen Geschwindigkeit von Transdoppel Phospholipid Bewegung physiologisch geeigneten Ebenen in einem bidirektionalen, ATP-unabhängige Weise ^4-6 erhöhen. Beispiele für ihre Aktionen können im endoplasmatischen Retikulum und bakterielle Cytoplasmamembran zu finden, wo die konstitutive Scrambling für Membran – Homöostase und Wachstum notwendig ist, aber auch für eine Vielzahl von Glycosylierungswege ^5. Reguliert Phospholipid Verwürfelung benötigt Phosphatidylserin (PS) auf der Oberfläche von apoptotischen Zellen zu belichten , wo es als ein "eat-me" -Signal für Makrophagen ⁷ und stellt eine prokoagulierende Oberfläche auf aktivierten Blutplättchen die Bildung von Proteinfaktor zu katalysierens für die Blutgerinnung benötigt. In Photorezeptorscheibenmembranen hat Scrambling Aktivität des Rhodopsin vorgeschlagen worden , das Phospholipid Ungleichgewicht zwischen den beiden Membran Blättchen der Bilayer entgegenzuwirken , die durch den ATP-abhängigen, unidirektionale Lipid erzeugt wird Flippase ABCA4 ^{4,8,9 10-12.}

Trotz der physiologischen Bedeutung von scramblases, ihre Identität blieb schwer bis Rhodopsin als Scramblase in Photorezeptor Scheiben berichtet wurde ^2, die Mitglieder des TMEM16 Proteinfamilie wurden als Ca ²⁺ identifiziert -abhängigen scramblases für PS – Exposition an der Plasmamembran benötigt (in Bezug prüft ¹³⁾ und das bakterielle Protein FTSW wurde vorgeschlagen , wie ein Lipid II für Peptidoglycansynthese ¹⁴ erforderlich Scramblase. Diese Entdeckungen wurden basierend auf der Rekonstitution von gereinigten Proteinen in Liposomen und Demonstration scramblase Aktivität in den resultierenden Proteo die Methodik describ Verwendunghier ed. Andere potenzielle scramblases ^15-21 – die MurJ und amj Proteine ​​in Peptidoglycan – Biosynthese beteiligt, WzxE und verwandte Proteine ​​verwickelt in Scrambling O-Antigen – Vorläufer, MPRF Protein benötigt aminoacylierten Phosphatidylglycerin über die bakterielle Cytoplasmamembran zu translozieren und Xkr8 Familienmitglieder , die vorgeschlagen wurden , PS auf der Oberfläche von apoptotischen Zellen zu belichten – bleiben biochemisch getestet werden. Dies unterstreicht die Bedeutung eines robusten Assays zu identifizieren und Scramblase Aktivität zu charakterisieren.

Hier beschreiben wir die Rekonstitution von gereinigten Opsin, das Apoprotein des Photorezeptors Rhodopsin, in große unilamellare Vesikel (LUVs) und anschließende Analyse der scramblase Aktivität in den resultierenden Proteo eine fluoreszenzbasierten Assay. Es gibt mehrere gut beschriebenen Protokolle in der Literatur für die heterologe Expression und Reinigung von Opsin, deshalb werden wir nichtbeschreiben sie in diesem Protokoll; wir verwenden , um die in Goren beschriebenen Protokolle et al. ³ , die bei etwa 100 ng / & mgr; l in 0,1% (w / v) Dodecylmaltosid (DDM) FLAG-markiertes, thermo Opsin ergibt.

Die Rekonstitution wird durch die Behandlung LUVs mit ausreichend Waschmittel erreicht, so dass sie anschwellen, aber nicht lösen. Unter diesen Bedingungen wird ein Membranprotein – in Form von Protein-Mizellen Detergenz zugeführt – werden in die Liposomen zu integrieren und in die Liposomenmembran nach Entfernung des Detergens rekonstituiert geworden in Proteo führt. Zu rekonstituieren Opsin (als gereinigtes Protein erhalten in 0,1% (w / v) DDM) sind LUVs aus einem Gemisch aus POPC hergestellt (1-Palmitoyl-2-oleoyl- sn – glycero-3-phosphocholin) und POPG (1- Palmitoyl-2-Oleoyl – sn – glycero-3- [phospho-rac- (1-Glycerin)]) und mit DDM gesättigt vor dem Hinzufügen von Opsin und NBD-PC. Das Detergens wird dann durch Behandlung der Probe mit Polystyrolkügelchen entfernt.

<p c lass = "jove_content"> Das Prinzip der Fluoreszenz basierenden Assay zugrundeliegende Aufgabe wird in 1B gezeigt. LUVs sind symmetrisch mit einer Spurenmenge von NBD-PC oder andere NBD-markierte fluoreszierende Phospholipid reporter (1A) rekonstituiert. Bei Zugabe von Dithionit, eine Membran-impermeablen Dianion, NBD-PC-Moleküle in dem äußeren Blatt der LUVs gerendert nichtfluoreszierenden als nitro-Gruppe von NBD ist mit einem nicht-fluoreszierenden Amino-Gruppe reduziert. Da weder NBD-PC-Moleküle noch Dithionit Lage sind, die Membran auf der Zeitskala des Versuchs (<10 min) zu durchlaufen, ergibt dies 50% ige Reduktion des Fluoreszenzsignals. schnell nach außen kann jedoch, wenn die Liposomen mit einem scramblase, NBD-PC-Moleküle in der inneren Faltblatt rekonstituiert werden verwürfeln, wo sie reduziert sind. Daraus ergibt sich der Gesamtverlust der Fluoreszenz im idealen Fall (Abbildung 1C).

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. Abbildung 1: Schematische Darstellung des Scramblase Aktivitätstest Der Test verwendet eine fluoreszierende NBD-markierten Reporter Lipid; NBD-PC angezeigt wird (A). Große unilamellare Vesikel sind mit einer Spurenmenge von NBD-PC rekonstituiert. Rekonstitution erzeugt symmetrischen Vesikeln mit NBD-PC gleichmäßig verteilt in den äußeren und inneren Blättchen. Dithionit (S ₂ O ₄ ^2-) reduziert chemisch die Nitrogruppe von NBD zu einem nicht-fluoreszierenden amino-Gruppe. Die Behandlung von proteinfreien Liposomen mit Dithionit (B, oben) bewirkt eine 50% ige Reduktion der Fluoreszenz , da nur die NBD-PC – Moleküle in der äußeren Leaflet reduziert: Dithionit negativ geladen ist und die Membran nicht überqueren können mit NBD-PC – Moleküle reagieren im inneren Blatt. Dithionit Behandlung von Opsin haltigen Proteo (B, unten), dh scramblase aktive Proteo, Ergebnisse in 100% Verlust der fluorescence als Opsin erleichtert die Bewegung von NBD-PC zwischen dem inneren und dem äußeren Faltblatt. (C) zeigt idealisierte Fluoreszenzspuren erhalten bei der Behandlung von proteinfreien Liposomen und Opsin haltigen Proteo mit Dithionit. Die Geschwindigkeit der Fluoreszenzverlust ist die gleiche in beiden Fällen das anzeigt, dass die chemische Reduktion von NBD von Dithionit ist geschwindigkeitsbestimmend, und das Verwürfeln bei einer Geschwindigkeit gleich oder größer ist als die Geschwindigkeit der chemischen Reaktion auftritt. Spuren von einem tatsächlichen Experiment sind in Abbildung 3 dargestellt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Methoden , die wir beschreiben , können verwendet werden , um andere gereinigten Proteine ​​zu rekonstituieren und Assay sowie Mischungen von Membranproteinen erhalten werden , beispielsweise durch Mikrosomen mit Waschmittel ²² zu extrahieren.