Een fluorescentie-gebaseerde test fosfolipide scramblase Activity

De fotoreceptor rhodopsine, een prototypisch G-eiwit gekoppelde receptor (besproken in bijvoorbeeld referentie ^1), is het eerste fosfolipide scramblase worden vastgesteld en geverifieerd biochemisch ^2,3. Scramblases zijn fosfolipiden transporters die de intrinsiek langzame transbilayer fosfolipiden beweging te verhogen tot fysiologisch passende niveaus in een bidirectionele, ATP-onafhankelijke wijze ^4-6. Voorbeelden van hun acties te vinden in het endoplasmatisch reticulum en bacteriële cytoplasmatische membraan waarbij constitutief versluiering nodig voor membraan homeostase en groei, alsmede voor een verscheidenheid van glycosyleringsroutes ^5. Gereguleerd fosfolipide versluiering nodig om fosfatidylserine (PS) op het oppervlak van apoptotische cellen bloot waar het als een "eet-me" -signaal voor macrofagen en ⁷ verschaft een procoagulant oppervlak op geactiveerde bloedplaatjes tot de productie van eiwit factor katalyserens die nodig zijn voor de bloedstolling. In fotoreceptor disc membranen heeft scrambling activiteit rhodopsine is voorgesteld om het fosfolipide onbalans tussen de twee membraanlagen folders van de bilaag die wordt gegenereerd door de ATP-afhankelijke unidirectionele lipide tegen flippase ABCA4 ^{4,8,9 10-12.}

Ondanks het fysiologische belang van scramblases, hun identiteit ongrijpbaar gebleven tot rhodopsine werd gerapporteerd als scramblase in fotoreceptor schijven ^2, leden van de eiwitfamilie TMEM16 geïdentificeerd als Ca2 ⁺ -afhankelijke scramblases nodig voor PS blootstelling bij de plasmamembraan (besproken in referentie ^13), en de bacteriële eiwit FtsW voorgesteld als een lipide II scramblase vereist peptidoglycaansynthese ^14. Deze ontdekkingen zijn gebaseerd op de reconstitutie van gezuiverde eiwitten in liposomen en demonstratie van scramblase activiteit in de verkregen proteoliposomen hand van de methode describHier ed. Andere potentiële scramblases ^15-21 – de MurJ en AMJ eiwitten die betrokken zijn bij de biosynthese van peptidoglycaan, WzxE en verwante eiwitten betrokken bij scrambling O-antigen voorlopers, MPRF eiwit nodig om aminogeacyleerde phosphatidylglycerol verplaatsen over het bacteriële cytoplasma membraan en Xkr8 familieleden die zijn voorgesteld bloot PS op het oppervlak van apoptotische cellen – nog moeten biochemisch testen. Dit benadrukt het belang van een robuuste test te identificeren en te karakteriseren scramblase activiteit.

Hier beschrijven we de bereiding van gezuiverde opsin het apo-eiwit van de fotoreceptor rhodopsine, in grote unilamellaire vesikels (LUV's) en daaropvolgende analyse van scramblase activiteit in de verkregen proteoliposomen met een op fluorescentie gebaseerde assay. Er zijn verscheidene goed beschreven protocols beschikbaar in de literatuur voor de heterologe expressie en zuivering van opsin, daarom zullen wij nietbeschrijven in dit protocol; We gebruiken het in Goren et al. ³ beschreven protocollen die FLAG-gemerkte, thermostabiel opsin levert ongeveer 100 ng / ul in 0,1% (w / v) dodecylmaltoside (DDM).

Reconstitutie wordt bereikt door behandeling LUVs voldoende wasmiddel zodat zij zwellen maar niet oplossen. Onder deze omstandigheden, een membraaneiwit – in de vorm van eiwit-detergens micellen meebrengen – te integreren in de liposomen en wordt opgelost in de liposoommembraan na verwijdering detergens, waardoor proteoliposomen. Opsin te reconstitueren (verkregen als een gezuiverd eiwit in 0,1% (w / v) DDM), worden LUV's bereid uit een mengsel van POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine) en POPG (1- palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3- [fosfo-rac- (1-glycerol)]) en verzadigd met DDM voor het toevoegen opsin en NBD-PC. Daarna wordt het detergens verwijderd door behandelen van het monster met polystyreen korrels.

<p c lass = "jove_content"> Uitgangspunt van de fluorescentie-gebaseerde test wordt getoond in figuur 1B. LUV symmetrisch gereconstitueerd met een sporenhoeveelheid NBD-PC of andere NBD-gelabelde fluorescente fosfolipide reporter (Figuur 1A). Het toevoegen dithioniet, is een membraan-impermeant dianion, NBD-PC moleculen in de buitenste laag van de LUV's worden weergegeven niet fluorescerende als de nitro-groep NBD tot een niet-fluorescerende aminogroep. Aangezien noch NBD-PC moleculen of dithioniet kunnen migreren door de op de tijdschaal van het experiment (<10 min) resulteert in 50% reductie van het fluorescentiesignaal. Indien de liposomen worden gereconstitueerd met een scramblase, NBD-PC moleculen in het binnenste leaflet kan snel scramble naar buiten waar zij worden gereduceerd. Dit resulteert in het totale verlies van fluorescentie in het ideale geval (figuur 1C).

es / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg "/>
. Figuur 1: Schematische weergave van de scramblase activiteit assay De assay maakt gebruik van een fluorescent-gelabelde reporter NBD lipide; NBD-PC is afgebeeld (A). Grote unilamellaire blaasjes gereconstitueerd met een sporenhoeveelheid NBD-PC. Reconstitutie produceert symmetrische blaasjes met NBD-PC gelijk verdeeld in de buitenste en binnenste folders. Dithioniet (S ₂ O ₄ ^2-) chemisch reduceert de nitro-groep NBD een niet-fluorescerende aminogroep. Behandeling van eiwitvrije liposomen met dithioniet (B, boven) veroorzaakt een reductie 50% van de fluorescentie omdat alleen het NBD-PC moleculen in de buitenste laag gereduceerd: dithioniet is negatief geladen en kan het membraan reageren met NBD-PC moleculen niet overschrijden in het binnenste leaflet. Dithioniet behandeling van opsin bevattende proteoliposomen (B, onder), dat wil zeggen, scramblase-actieve proteoliposomen, resulteert in 100% verlies van fluorescence als opsin vergemakkelijkt beweging van NBD-PC tussen de binnenste en de buitenste laag. (C) toont geïdealiseerde fluorescentie sporen verkregen op de behandeling van eiwitvrije liposomen en-opsin bevattende proteoliposomen met dithioniet. De snelheid van fluorescentie verlies is hetzelfde in beide gevallen aangeeft dat de chemische reductie van NBD door dithioniet is snelheidsbeperkende, en dat klauteren gebeurt met een snelheid die gelijk is aan of groter is dan de snelheid van de chemische reactie. Sporen verkregen uit een eigenlijke experiment zijn weergegeven in figuur 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De werkwijzen beschrijven we kunnen worden gebruikt voor het reconstitueren en andere testen gezuiverde eiwitten, alsmede mengsels van membraaneiwitten verkregen, bijvoorbeeld door extractie met detergens microsomen ^22.