Preparação de CD4<sup> +</sup> As células T para Análise de GD3 e GD2 gangli�idos Membrane Expressão por microscopia
Summary
Descreve-se um protocolo de coloração de anticorpo padrão para utilização em microscopia para determinar a expressão e localização da membrana de gangliósidos em repouso e as células naive humanas activadas T CD4 +. Também estão descritos em tempo real utilizando experiências de PCR <40.000 células que não requerem kits adicionais baixos de ARN de entrada.
Abstract
Os métodos aqui descritos para a activação de células T CD4 + naive em suspensão e a sua aderência em lamelas para análise por microscopia confocal de permitir que a localização espacial e a visualização de gangliósidos envolvidos na activação de células T CD4 +, que a expressão do complemento profiling experiências, tais como citometria de fluxo, Western borrar ou PCR em tempo real. A quantificação da expressão gangliósido através de citometria de fluxo e a sua localização celular através de microscopia pode ser obtido através da utilização de anticorpos anti-gangliósidos com elevada afinidade e especificidade. No entanto, um tratamento adequado de células em suspensão envolve o tratamento de placas de cultura para promover a adesão necessária exigida para a fluorescência ou a aquisição de microscopia confocal. Neste trabalho, nós descrevemos um protocolo para determinar GD3 e GD2 expressão gangliósido e co-localização com a TCR durante a ativação de células CD4 + T naïve. Além disso, real-time experiências de PCR utilizando <40.000 células são descritos para a determinação da GD3 e genes da sintase de GM2 / GD2, demonstrando que as experiências de análise genética pode ser realizada com um baixo número de células e, sem a necessidade de kits adicionais baixos de ARN de entrada.
Introduction
As células T CD4 + orquestrar a resposta imune através das suas funções efectoras após activação por apresentação de antigénio de células 1. O estudo dos mecanismos celulares que são modulados durante a activação permite uma visão sobre um processo básico da função imune. No entanto, o estudo de células T CD4 + naive pode ser complicado porque representam uma população muito pequena de células na periferia sangue 2.
Por meio de microscopia de fluorescência vários relatórios estudaram a localização de diferentes moléculas envolvidas na activação de células T CD4 +, principalmente proteínas associadas à membrana plasmática 3. Os gangliósidos são glicosfingolípidos que contém ácido siálico e embora tenham sido extensivamente estudados em células nervosas, onde eles são abundantes, outras células, tais como células do sistema imunológico, também expressam gangliosidos com funções biologicamente relevantes 4,5. Nós relatado anteriormente thaT durante a activação de células T CD4 + naive humanas existe uma regulação positiva do α2,8 sialiltransferase ST8Sia 1 (GD3-sintase) e a sintase GM2 / GD2, que induzem a neoexpression superfície significativa de GD2 e a regulação positiva de gangliósido GD3 6. Um estudo mais aprofundado de GD3, GD2 e outros gangliósidos em células do sistema imunológico é necessária para complementar uma vista parcial à base de proteína de função imunológica.
Geralmente, o estudo da expressão de gangliósido é baseado em técnicas tais como cromatografia em camada fina (TLC) 7, mas esta técnica não permite que a localização espacial de gangliósidos na membrana plasmática ou em compartimentos subcelulares, limitando análise biológica.
Neste trabalho, nós descrevemos um protocolo para a identificação de anticorpos e mediada por localização de GD3 e GD2 gangliósidos em células T CD4 + naive humanas PBMC e depois com anti-CD3 / anti-CD28 de activação. Com este protocolo que ié também possível analisar o gene e a expressão de gangliósidos molecular num baixo número de células em suspensão, com a aquisição de imagens de alta qualidade 6, considerando o tamanho pequeno dos linfócitos (9 jiM).
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito pode ser usado para localizar gangliósidos ou proteínas em suspensões de células de células T CD4 + ou de outras células imunitárias (por exemplo, PMBC, figura 5) a partir de um pequeno número de células. Devido ao tamanho pequeno de células T e as propriedades não-aderentes, a aquisição de imagens microscópicas de fluorescência resulta em informação deficiente ou baixa qualidade, se as células não são correctamente aderida.
<p class="jove…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. José Luis Daniotti for comments. We thank the assistance to Dr. J. Arturo Pimentel and the Laboratorio Nacional de Microscopìa Avanzada-UNAM for acquisition of confocal images. I.M.-D. and T.M.V.C. were supported by grants 157634 and 253596 from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiologìa, A.C. T.M.V.-C. is recipient of a scholarship (245192) from CONACYT. We also thank the support of the Red Temática Glicociencia en Salud – CONACYT (253596).
Materials
| Advanced RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | Suplemented with 3% FBS |
| mouse anti human CD3 antibody | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 clone |
| mouse anti human CD28 antibody | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 clone |
| mouse anti human GD3 antibody | Abcam | ab11779 | R24 clone |
| mouse anti human GD2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a clone |
| FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody |
Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a antibody | |||
| Alexa Fluor 647 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a antibody | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Sorting | |
| Nunc Lab-tek chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus) | Olympus | Upright BX61WI and IX81 | |
| Forward sequence primer GD3 synthase | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GD3 synthase | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | Ref. 7 | |
| Forward sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | Ref. 7 |
References
- Mazzon, C., Viola, A. From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse. Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).
- Hamann, D., Pa Baars, ., Hooibrink, B., van Lier, R. W. Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms. Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).
- Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation. Biomed Res Int. , 276498 (2013).
- Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation. Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).
- Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).
- Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters. Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).
- Müthing, J. TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids. Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).
- de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
- O’Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).
- Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).
- Marconi, S., Acler, M., et al. Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients. Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).
- Park, J. E., Wu, D. Y., et al. Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand. Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).
- Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis. Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).
- Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex. J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).
- Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control. Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).
- Yamashiro, S., Okada, M., et al. Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes. Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).
- Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes. Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).
- Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody. J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).
