Получение CD4<sup> +</sup> Т-клеток для анализа GD3 и GD2 Ганглиозид Мембранная Expression микроскопией
Summary
Описан стандартный протокол с использованием меченых антител для применения в микроскопии для определения экспрессии мембранного и локализации ганглиозидов в состоянии покоя , а также активированные человека наивных CD4 + Т – клеток. Также описаны в режиме реального времени эксперименты с использованием ПЦР <40000 клеток, которые не требуют дополнительных комплектов низкого входного РНК.
Abstract
Описанные здесь способы для активации наивных CD4 + Т – клеток в суспензии и их соблюдение в покровные для конфокальной микроскопический анализ позволяют пространственную локализацию и визуализацию ганглиозидов , участвующих в активации CD4 + Т – клеток, что экспрессия комплемента профилирование эксперименты , такие как проточная цитометрия, вестерн блоттинга или ПЦР в реальном времени. Количественное выражение ганглиозидов через проточной цитометрии и их клеточной локализации с помощью микроскопии может быть получена при использовании анти-ганглиозидов антител с высоким сродством и специфичностью. Тем не менее, адекватная обработка клеток в суспензии включает обработку культуры пластин для содействия необходимой для соблюдения требуемой флуоресценции или конфокальной микроскопии приобретения. В этой работе мы опишем протокол для определения экспрессии ганглиозидов GD3 и GD2 и колокализацию с TCR во время активации наивных CD4 + Т – клеток. Кроме того, в режиме реального тЭксперименты IME ПЦР с использованием <40000 клеток описаны для определения GD3 и генов-синтазы GM2 / GD2, демонстрируя, что эксперименты генного анализа могут быть выполнены с низким числом клеток и без необходимости дополнительных комплектов низкого входного РНК.
Introduction
CD4 + Т – клетки оркестровать иммунный ответ через свои эффекторные функции после активации антигенпрезентирующих клеток 1. Изучение клеточных механизмов, которые модулируются при активации позволяет понимание основного процесса иммунной функции. Тем не менее, исследование наивных CD4 + Т – клеток может быть сложным , так как они представляют собой очень небольшую популяцию клеток в крови периферии 2.
С помощью флуоресцентной микроскопии несколько сообщений изучали локализацию различных молекул , участвующих в активации CD4 + Т – клеток, в основном белки , связанные с плазматической мембраной 3. Ганглиозиды являются сиаловой кислоты , содержащие гликосфинголипиды и , хотя они были широко изучены в нервных клетках , где они в изобилии, другие клетки , такие как клетки иммунной системы также выражают ганглиозиды биологически соответствующими функциями 4,5. Ранее мы сообщали ТНАт при активации человека наивных CD4 + Т – клеток существует повышающая регуляция в α2,8 сиалилтрансфераза ST8Sia 1 (GD3 – синтазы) и синтазы GM2 / GD2, которые вызывают значительную поверхность neoexpression из GD2 и повышающая регуляция GD3 ганглиозида 6. Дальнейшее изучение GD3, GD2 и других ганглиозидов в иммунных клетках необходимо дополнить на основе протеина частичный вид функции иммунной системы.
Как правило, изучение экспрессии ганглиозидной основывается на таких методов, как тонкослойная хроматография (ТСХ) 7, но этот метод не позволяет пространственной локализации ганглиозидов на плазматической мембране или в субклеточных отсеков, ограничивая биологический анализ.
В этой работе мы опишем протокол для идентификации антител-опосредованной и локализации GD3 и GD2 ганглиозидов в человеческих наивных CD4 + Т – клеток и МКПК после анти-CD3 / активации анти-CD28. С помощью этого протокола это яТакже возможно анализировать ген и молекулярную экспрессию ганглиозидов в низком количестве клеток в суспензии, с приобретением высококачественных изображений 6, принимая во внимание небольшой размер лимфоцитов (9 мкм).
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный протокол может быть использован для локализации ганглиозидов или белков в суспензии клеток CD4 + Т – клеток или других клеток иммунной системы (например, PMBCs, рисунок 5) , начиная с небольшого числа клеток. Из-за небольшого размера Т-клеток и не-адгезивных свой?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. José Luis Daniotti for comments. We thank the assistance to Dr. J. Arturo Pimentel and the Laboratorio Nacional de Microscopìa Avanzada-UNAM for acquisition of confocal images. I.M.-D. and T.M.V.C. were supported by grants 157634 and 253596 from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiologìa, A.C. T.M.V.-C. is recipient of a scholarship (245192) from CONACYT. We also thank the support of the Red Temática Glicociencia en Salud – CONACYT (253596).
Materials
| Advanced RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | Suplemented with 3% FBS |
| mouse anti human CD3 antibody | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 clone |
| mouse anti human CD28 antibody | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 clone |
| mouse anti human GD3 antibody | Abcam | ab11779 | R24 clone |
| mouse anti human GD2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a clone |
| FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody |
Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a antibody | |||
| Alexa Fluor 647 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a antibody | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Sorting | |
| Nunc Lab-tek chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus) | Olympus | Upright BX61WI and IX81 | |
| Forward sequence primer GD3 synthase | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GD3 synthase | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | Ref. 7 | |
| Forward sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | Ref. 7 |
References
- Mazzon, C., Viola, A. From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse. Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).
- Hamann, D., Pa Baars, ., Hooibrink, B., van Lier, R. W. Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms. Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).
- Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation. Biomed Res Int. , 276498 (2013).
- Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation. Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).
- Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).
- Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters. Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).
- Müthing, J. TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids. Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).
- de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
- O’Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).
- Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).
- Marconi, S., Acler, M., et al. Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients. Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).
- Park, J. E., Wu, D. Y., et al. Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand. Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).
- Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis. Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).
- Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex. J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).
- Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control. Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).
- Yamashiro, S., Okada, M., et al. Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes. Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).
- Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes. Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).
- Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody. J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).
