Citoplasmática microinjeção no gado zigotos assistida laser
Summary
This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.
Abstract
Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.
Introduction
microinjecção citoplasmática de embriões de 1 célula é uma técnica muito potente. Ele pode ser usado para a entrega de qualquer solução para o embrião com, por exemplo, produzir gene knock-out para estudar a função do gene ou para gerar animais editado por genes. Zigotos de animais de exploração agrícola mais relevantes têm uma composição de ácidos graxos muito elevado que faz com que seu citoplasma opaco e escuro 1. Eles também têm uma membrana plasmática bastante elásticas (PM). Estas características fazem microinjeção usando pronuclear injeção convencional / citoplasmática como usado em espécies de roedores desafiadoras e muitas vezes imprecisas.
Microinjecção citoplasmática tem vantagens sobre microinjecção pronuclear, uma vez que é mais fácil de executar e também causa menos danos para os embriões injectados, resultando em maior viabilidade 2. O objetivo geral deste protocolo é demonstrar um método bem sucedido para a entrega de soluções para o citoplasma de zigotos de animais de exploração. Para ser capaz de realizarmicroinjecção citoplasmática com alta eficiência em embriões de gado, é usado um laser para gerar um furo na zona pelúcida (ZP) e então, uma agulha de extremidade romba de vidro é usado para a microinjecção. Esta estratégia visa reduzir os danos mecânicos impressa no embrião durante a injeção. Em seguida, o conteúdo citoplasmático de aspiração no interior da agulha de injecção permite a quebra eficiente e confiável do PM assegurar que a solução é fornecida para dentro do citoplasma do embrião.
Esta técnica já sido utilizado com sucesso em embriões de bovinos para entregar siRNA para o citoplasma zigótica 3,4 e para gerar mutações que utilizam as repetições curtas em cluster regularmente interespaçadas palindrómicos (CRISPR) / CRISPR associada do sistema 9 de sistema (Cas9) 5. É igualmente apropriado (com pequenas modificações) para injetar bovina oócitos inclusos-cumulus 6. Aqui, descrevemos nosso protocolo de injeção de entregar um corante, que podem ser aplicáveis a injeção de qualquer dessolução Ired no zigoto, e mostrar que usando esta técnica provoca lise mínima e não afeta o desenvolvimento embrionário precoce.
Protocol
Representative Results
Discussion
A microinjecção de zigotos é um método bem estabelecido para a introdução de soluções em embriões de mamíferos. Com algumas variações dependentes das espécies e o objectivo da experiência, esta técnica pode ser usado de forma ampla. Mostramos como executar microinjecção intracitoplasmática usando um laser para ajudar na entrada de uma micropipeta de extremidade romba. Os zigotos de algumas espécies animais (tais como gado bovino, ovelhas, e porcos) têm um citoplasma escuro, dificultando a visualizaç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work related to this technique is supported by NIH/NICHD RO1 HD070044 and USDA/NIFA Hatch projects W-3171 and W-2112.
Materials
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glass capillary | Sutter instruments | B100-75-10 | These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used. |
| Microforge | Narishige | MF-9 | Equipped with 10X magnification lense. |
| Micromanipulator | Nikon/ Narishige | NT88-V3 | |
| Inverted microscope | Nikon | TE2000-U | Equipped with 4x, 20x lenses and with a laser system. |
| Laser | Research Instruments | 7-47-500 | Saturn 5 Active laser. |
| Microdispenser | Drummond | 3-000-105 | The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible. |
| 60mm culture dish | Corning | 430166 | Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micropipettes with the micromanipulator easier. |
| 35mm culture dish | Corning | 430165 | These dishes are used for culturing the embryos in 50μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hours prior to transfering the embryos to them. |
| Incubator | Sanyo | MCO-19AIC | Any incubator that can be set to 38.5°C 5% CO2 conditions can be used. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10x magnification can be used. |
| Control Unit HT | Minitube | 12055/0400 | Heating system attached to the stereomicroscope. |
| Heated Microscope Stage | Minitube | 12055/0003 | Heating system attached to the stereomicroscope. |
| Dextran-Red | Thermo Scientific | D1828 | A sterile 10mg/ml solution is used to inject. |
| Mineral Oil | sigma | M8410 | Keep the mineral oil at room temperature and protected from light using foil paper. |
| KSOMaa Evolve Bovine | Zenit | ZEBV-100 | Supplemented with 4mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hours before use. |
| FBS | Gemini-Bio | 100-525 | Use a stem-cell qualified FBS. |
| Zygotes | Zygotes are injected 17-20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived. | ||
| NaCl | Sigma | S5886 | Final concentration: 107.7mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| KCl | Sigma | P5405 | Final concentration: 7.16mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Final concentration: 1.19mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| MgCL2 6H2O | Sigma | M2393 | Final concentration: 0.49mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Sodium DL-lactate | Sigma | L4263 | Final concentration: 5.3mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| CaCl2-2H2O | Sigma | C7902 | Final concentration: 1.71mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| D-(−)-Fructose | Sigma | F3510 | Final concentration: 0.5mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| HEPES | Sigma | H4034 | Final concentration: 21mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| MEM-NEAA | Sigma | M7145 | Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium. |
| BME-EAA | Sigma | B6766 | Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium. |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Final concentration: 4mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | Final concentration: 0.33mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Glutamax | Gibco | 35050 | Final concentration: 1mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| BSA | Sigma | A-3311 | Final concentration: 1mg/ml. Component of SOF-HEPES medium. |
| Gentamicin | Sigma | G-1397 | Final concentration: 5μg/ml. Component of SOF-HEPES medium. |
| Water for embryo transfer | Sigma | W1503 | Component of SOF-HEPES medium. |
| SOF-HEPES medium | Made in the lab | pH 7.3-7.4, 280±10 mOs. Filter sterilized through a 22μm filter can be stored in the fridge at 4° C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use. |
References
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