Laser-assisted Cytoplasmatische Micro-injectie in Livestock Zygotes
Summary
This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.
Abstract
Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.
Introduction
Cytoplasmatische micro-injectie van 1-cel embryo is een zeer krachtige techniek. Het kan worden gebruikt voor het afleveren van elke oplossing in het embryo, bijvoorbeeld, produceren gen knock-outs voor bestudering van genfunctie of gen aangepast dieren te genereren. De meeste landbouw-relevante boerderijdier zygoten hebben een zeer hoge vetzuursamenstelling dat hun cytoplasma ondoorzichtig en donker 1 maakt. Ze hebben ook een vrij elastisch plasmamembraan (PM). Deze eigenschappen maken van micro-injectie met behulp van conventionele pronucleaire / cytoplasmatische injectie zoals gebruikt in knaagdieren uitdagende en vaak onnauwkeurig.
Cytoplasmatische micro-injectie heeft voordelen ten opzichte pronucleaire microinjectie omdat het makkelijker uit te voeren en veroorzaakt ook minder schade aan de geïnjecteerde embryo, wat resulteert in hogere levensvatbaarheid 2. Het algemene doel van dit protocol is om een succesvolle methode te demonstreren voor het leveren van oplossingen in het cytoplasma van de boerderij dierlijke zygoten. Om te kunnen presterencytoplasmatische micro-injectie met een hoge efficiëntie op vee embryo wordt een laser gebruikt om een gat in de zona pellucida (ZP) en vervolgens een stompe uiteinden glazen naald wordt gebruikt voor de micro-injectie genereren. Deze strategie is gericht op de mechanische schade afgedrukt op het embryo tijdens de injectie te verminderen. Vervolgens aspiratie cytoplasmatische inhoud binnen de injectienaald maakt een efficiënte en zekere breuk van de PM verzekeren dat de oplossing in het cytoplasma van de embryo wordt geleverd.
Deze techniek werd reeds met succes toegepast in runderembryo's naar siRNA geven in de zygotische cytoplasma 3,4 en mutaties met de geclusterde regelmatig op afstand van elkaar korte palindroom repeats (CRISPR) / CRISPR systeemcomponent 9 (Cas9) systeem 5 genereren. Het is ook geschikt (met kleine wijzigingen) aan runder-cumulus ingesloten oöcyten 6 injecteren. Hier hebben we onze injectieprotocol leveren van een kleurstof beschreven, kunnen die welke voor het injecteren van elke des teIRED oplossing in de zygote, en laten zien dat met deze techniek geeft vrijwel geen lysis en heeft geen invloed op de vroege embryonale ontwikkeling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Micro-injectie van zygoten is een bekende methode voor het introduceren van oplossingen in zoogdierlijke embryo. Bij sommige variaties afhankelijk van de soort en het doel van het experiment, kan deze techniek ruimer toegepast. We zien hoe intracytoplasmatische microinjectie uitvoeren aan laser naar de ingang van een stompe uiteinden micropipet staan. Zygoten van sommige diersoorten (zoals runderen, schapen en varkens) een donkere cytoplasma, belemmeren de visualisatie van de injectiepipet eenmaal in het embryo. Ook hun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work related to this technique is supported by NIH/NICHD RO1 HD070044 and USDA/NIFA Hatch projects W-3171 and W-2112.
Materials
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glass capillary | Sutter instruments | B100-75-10 | These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used. |
| Microforge | Narishige | MF-9 | Equipped with 10X magnification lense. |
| Micromanipulator | Nikon/ Narishige | NT88-V3 | |
| Inverted microscope | Nikon | TE2000-U | Equipped with 4x, 20x lenses and with a laser system. |
| Laser | Research Instruments | 7-47-500 | Saturn 5 Active laser. |
| Microdispenser | Drummond | 3-000-105 | The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible. |
| 60mm culture dish | Corning | 430166 | Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micropipettes with the micromanipulator easier. |
| 35mm culture dish | Corning | 430165 | These dishes are used for culturing the embryos in 50μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hours prior to transfering the embryos to them. |
| Incubator | Sanyo | MCO-19AIC | Any incubator that can be set to 38.5°C 5% CO2 conditions can be used. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10x magnification can be used. |
| Control Unit HT | Minitube | 12055/0400 | Heating system attached to the stereomicroscope. |
| Heated Microscope Stage | Minitube | 12055/0003 | Heating system attached to the stereomicroscope. |
| Dextran-Red | Thermo Scientific | D1828 | A sterile 10mg/ml solution is used to inject. |
| Mineral Oil | sigma | M8410 | Keep the mineral oil at room temperature and protected from light using foil paper. |
| KSOMaa Evolve Bovine | Zenit | ZEBV-100 | Supplemented with 4mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hours before use. |
| FBS | Gemini-Bio | 100-525 | Use a stem-cell qualified FBS. |
| Zygotes | Zygotes are injected 17-20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived. | ||
| NaCl | Sigma | S5886 | Final concentration: 107.7mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| KCl | Sigma | P5405 | Final concentration: 7.16mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Final concentration: 1.19mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| MgCL2 6H2O | Sigma | M2393 | Final concentration: 0.49mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Sodium DL-lactate | Sigma | L4263 | Final concentration: 5.3mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| CaCl2-2H2O | Sigma | C7902 | Final concentration: 1.71mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| D-(−)-Fructose | Sigma | F3510 | Final concentration: 0.5mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| HEPES | Sigma | H4034 | Final concentration: 21mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| MEM-NEAA | Sigma | M7145 | Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium. |
| BME-EAA | Sigma | B6766 | Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium. |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Final concentration: 4mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | Final concentration: 0.33mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Glutamax | Gibco | 35050 | Final concentration: 1mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| BSA | Sigma | A-3311 | Final concentration: 1mg/ml. Component of SOF-HEPES medium. |
| Gentamicin | Sigma | G-1397 | Final concentration: 5μg/ml. Component of SOF-HEPES medium. |
| Water for embryo transfer | Sigma | W1503 | Component of SOF-HEPES medium. |
| SOF-HEPES medium | Made in the lab | pH 7.3-7.4, 280±10 mOs. Filter sterilized through a 22μm filter can be stored in the fridge at 4° C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use. |
References
- McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida. J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).
- Ross, P. J., et al. Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta. BMC Dev Biol. 8 (1), (2008).
- Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).
- Bogliotti, Y. S., et al. 4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes. Reprod Fertil Dev. 27 (1), 94-94 (2015).
- Bakhtari, A., Ross, P. J. DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos. Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).
- Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes. Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).
- Sutter Instrument. . Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. , (2015).
- Sutter Instrument. . P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 – DOM (20140825). , (2014).
- Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. . Principles of cloning. , (2002).
- Wang, B., et al. Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes. Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).
