Summary

El desarrollo de un anticuerpo salival múltiplex inmunoensayo para medir la exposición humana a los patógenos ambientales

Published: September 12, 2016
doi:

Summary

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

Abstract

La etiología y los efectos de la exposición humana a los patógenos ambientales son de gran preocupación en todo el mundo y, por lo tanto, la capacidad para evaluar la exposición y las infecciones de costos, utilizando métodos eficaces de alto rendimiento sería indispensable. Este manuscrito describe el desarrollo y análisis de un inmunoensayo basado en perlas multiplex capaz de medir la presencia de anticuerpos en la saliva humana a múltiples patógenos simultáneamente. La saliva es particularmente atractivo en esta aplicación, ya que no es invasiva, más barato y más fácil de recoger que el suero. Antígenos de patógenos ambientales fueron acoplados a microesferas carboxiladas (perlas) y se utilizan para medir los anticuerpos en volúmenes muy pequeños de muestras de saliva humanos utilizando un ensayo basado en perlas, solución de fase. Las bolas se acoplan con antígenos de Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovirus (G y G I.1 II.4) y virus de hepatitis A. Para asegurarse de que los antígenos se acoplan a suficientementelas perlas, el acoplamiento se confirmó utilizando especies específicas, anticuerpos de captura primaria de origen animal, seguido de incubación con biotina anti-anticuerpos de detección de especies secundarias y reportero de estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE). Como control para medir la unión no específica, un conjunto de microesferas se trató de forma idéntica a los otros excepto que no se acopló a cualquier antígeno. Las perlas de antígeno acoplado y de control se incubaron con muestras de saliva humanos recogidos prospectivamente-, medido en un analizador de alto rendimiento basado en los principios de la citometría de flujo, y la presencia de anticuerpos frente a cada antígeno se midió en unidades de intensidad mediana de fluorescencia (MFI) . Este inmunoensayo multiplex tiene una serie de ventajas, incluyendo más datos con menos de la muestra; reducción de los costes y mano de obra; y la capacidad de personalizar el ensayo para muchas dianas de interés. Los resultados indican que el inmunoensayo múltiplex salival puede ser capaz de identificar las exposiciones y las infecciones anteriores, que puede ser especiaLLY útil en estudios de vigilancia que involucran grandes poblaciones humanas.

Introduction

Ochenta y ocho por ciento de las enfermedades relacionadas con la diarrea todo el mundo se asocia con la exposición humana a agua contaminada, los alimentos insalubres, y la falta de saneamiento / higiene, causando aproximadamente 1,5 millones de muertes, la mayoría de los cuales son niños 1. Esta es una de las principales causas de preocupación para los funcionarios de salud pública y los responsables políticos. En un esfuerzo por investigar exposiciones y enfermedades asociadas con la navegación y otros patógenos ambientales, hemos desarrollado un inmunoensayo múltiplex para medir los anticuerpos en muestras humanas 2-4. Este método se puede aplicar a los estudios epidemiológicos para determinar la exposición humana a estos patógenos y definir mejor las infecciones immunoprevalence e incidentes.

La saliva es muy prometedora como una alternativa al suero para la investigación de biomarcadores humanos. Entre las ventajas de usar saliva son la no invasividad y la facilidad de la recogida de muestras, bajo coste, y las muestras pueden ser fácilmente recogidos de los niños de 5-7 </ Sup>. Las muestras de suero y saliva se han estudiado ampliamente para anticuerpos contra H. pylori 2,3,8, 9 Plasmodium falciparum, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumoniae 12, virus de la hepatitis A y C 13-14, norovirus 2-4,15, T. gondii 2-4, virus dengue 16, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) 17, y Escherichia coli O157: H7 18.

Un inmunoensayo multiplex permite el análisis de múltiples analitos simultáneamente dentro de un solo volumen de muestra y dentro de un solo ciclo o correr. Antígenos de C. multiplexados jejuni, T. gondii, H. pylori, hepatitis A virus, y dos norovirus se utilizaron para medir humano salival IgG e IgA 2-4 3,4 y respuestas de anticuerpos de IgG en plasma de 2,3 a estos patógenos utilizando unabasado en perlas inmunoensayo multiplexación. Cuando se utiliza en conjunción con estudios epidemiológicos de la exposición a microbios en el agua, el suelo y los alimentos, del tipo de ensayo descrito en este estudio puede proporcionar información valiosa para mejorar la comprensión de las infecciones causadas por patógenos ambientales. Además, los datos de anticuerpos salivales obtenidos de tales estudios se pueden usar para mejorar los modelos de evaluación de riesgos 19-22.

Protocol

Se obtuvo la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB # 08 a 1844, Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, Carolina del Norte, EE.UU.) para la recogida de muestras de saliva crevicular con hiperestimulación de los bañistas en la playa de Boquerón, Puerto Rico, como parte de los Estados Unidos Agencia de Protección ambiental (EPA) Epidemiológica Nacional y Evaluación ambiental del recreativas (neear) Estudio del agua 23 para evaluar las exposiciones y enfermedades asociadas nataci?…

Representative Results

Un conjunto de microesferas único se utilizó como control para medir la unión no específica y una muestra a la variabilidad. Estas perlas se trataron de forma idéntica a las perlas de antígeno junto con la excepción de que no se incubaron con cualquier antígeno en la etapa de acoplamiento. valores de MFI> 500 obtenidos a partir de las bolas de control incubadas con todas las muestras de saliva fueron retirados de los nuevos análisis debido a la sospecha de una contaminación …

Discussion

Estos resultados indican que el método de inmunoensayo multiplex es útil para discriminar entre muestras de saliva que son immunopositive o immunonegative. Para determinar immunopositivity, un solo punto de corte fue desarrollado por el cálculo de la media más tres desviaciones estándar de las respuestas de registro transformado IFM de las perlas no acoplados de control probados con todas las muestras de saliva. El punto de corte concede la capacidad de evaluar la exposición y immunoprevalence ya sea a solas o mú…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Clarissa Curioso was supported through an appointment to the Research Participation Program at the U.S. Environmental Protection Agency administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education through an interagency agreement between the U.S. Department of Energy and U.S. EPA.

Materials

Equipment and Software
Microcentrifuge Thermo Electron Corporation 75002446 Used to centrifuge samples
Vortex Mixer VWR G560 Used to mix samples
Sonicator (mini) Fisher Scientific 15-337-22 Used to separate beads
Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. Capp Various
Hemacytometer (Bright Line) Housser Scientific  3200 Used to count coupled beads
Multiscreen Vacuum Manifold Millipore MSVMHTS00 Used in washing steps to remove supernatant
MicroShaker VWR 12620-926 Used to agitate beads during incubations
Tube rack (1.5mL and 0.5mL) (assorted) VWR 30128-346
Weighing Scale Mettler or other Used to measure wash reagents for making buffers
Dynabead Sample Mixer Invitrogen 947-01 Used during coupling incubation step
MatLab (R2014b) The MathWorks, Inc. Used to analyze antibody response data
Microsoft Excel 2014 Microsoft Corporation Used to analyze antibody response data
Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software Luminex Corporation LX200-XPON3.1 Instrument and software used to run assay
Antigens
GI.1 Norwalk Virus : p-particle Xi Jiang (CCHMC)* NA  *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
GII.4 Norovirus VA387 : p-particle Xi Jiang (CCHMC)* NA  *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
Hepatitis A Virus : grade II concentrate from cell culture Meridian Life Sciences 8505 Antigen coupled at 100 µg
Helicobacter pylori : lysate Meridian Life Sciences R14101 Antigen coupled at 25 µg
Toxoplasma gondii : recombinant p30 (SAG1) Meridian Life Sciences R18426 Antigen coupled at 25 µg
Campylobacter jejuni : heat killed whole cells KPL 50-92-93 Antigen coupled at 50 µg
Primary Antibodies
Guinea pig anti-Norovirus (CCHMC)* NA Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG Meridian Life Sciences C65885M Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG Meridian Life Sciences C65885M Used for coupling confirmation
BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori KPL 01-93-94 Used for coupling confirmation
Goat pAb to Toxoplasma gondii Abcam Ab23507 Used for coupling confirmation
BacTrace Goat anti-Campylobacter species KPL 01-92-93 Used for coupling confirmation
Secondary  Antibodies
Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) Jackson 705-065-149 Used for coupling confirmation
Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) KPL 16-13-06 Used for coupling confirmation
Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) KPL 16-18-06 Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG(H+L) KPL 176-1506 Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Human IgG(ᵞ)  KPL 16-10-02 Used for Salivary Immunoassay
Consumables
1.5 mL copolymer microcentrifuge tubes USA Scientific 1415-2500 Used as low binding microcentrifuge tubes
10 µL pipette tip refills BioVentures 5030050C
200 µL pipette tip refills BioVentures 5030080C
1000 µL pipette tip refills BioVentures 5130140C
Aluminum foil Various Vendors Used keep beads in the dark during incubations
Deep Well plates VWR 40002-009 Used for diluting saliva samples
Multiscreen Filter Plates Millipore MABVN1250 Used to run assays
Oracol saliva collection system Malvern Medical Developments Limited Used for saliva collection
Reagents
Carboxylated microspheres (beads) Luminex Corporation Dependent on bead set Antigens are coupled to the microspheres
EDC (1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) Pierce 77149 or 22980 Used in bead activation
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Pierce 24510 Used in bead activation
Steptavidin-R-phycoerythrin (1mg/mL) Molecular Probes S-866 Used as reporter
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma M-2933 Used for coupling
Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) Sigma P-9416 Used in wash buffer to remove non-specific binding
Protein Buffers
PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, pH 7.4 Sigma P-3813 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
BSA Sigma A-7888 0.1% (w/v)
Tween-20 Sigma P-9416 0.2% (v/v)
Sodium Azide (0.05% azide)** Sigma S-8032 **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws.
MES/ Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0)
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma S-3139
5 N NaOH Fisher SS256-500
Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4)  Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, 1% BSA, pH 7.4 Sigma P-3688 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA
Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) Filter Sterilize and store at 4°C
NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) Sigma S-3139 0.1M NaH2PO4
5 N NaOH Fisher SS256-500
Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 Sigma P-3563 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN

References

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Augustine, S. A. J., Eason, T. N., Simmons, K. J., Curioso, C. L., Griffin, S. M., Ramudit, M. K. D., Plunkett, T. R. Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens. J. Vis. Exp. (115), e54415, doi:10.3791/54415 (2016).

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