Bir Tükürük Antikor Multiplex Immuoassay Gelişmekte Çevre Patojenler İnsan Pozlama'yı Tedbir
Summary
In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.
Abstract
etiyoloji ve çevresel patojenlere karşı insan maruziyet etkileri dolayısıyla, pozlama ve enfeksiyonlar kullanarak maliyetli, yüksek hacimli yaklaşımları değerlendirmek yeteneği vazgeçilmez olacağını, dünya çapında önemli bir endişe ve. Bu yazıda, aynı anda birden fazla patojen insan tükürük antikorların varlığı ölçebilen bir tane bazlı çoklu immunoassay geliştirilmesi ve analizini açıklamaktadır. o, invaziv olmayan ucuz ve serum daha toplamak için kolaydır çünkü tükürük bu uygulamada özellikle çekici. Çevresel patojenlerinin antijenlerinin karboksillenmiş mikrosferler (taneleri) birleştirilmiş bir tane bazlı, solüsyon faz tahlili kullanılarak insan tükürük örnekleri çok küçük hacimlerde antikorları ölçmek için kullanılmıştır. Boncuk Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, Noroviruses (G I.1 ve G II.4) antijenleri ve hepatit A virüsü ile birleştirildi. antijenler yeterli birleştirildi sağlamakboncuklar, birleştirme biyotinlenmiş anti-tür ikincil bir saptama antikorları ve streptavidin-R-fikoeritrin muhabir (SAPE) ile kuluçkalandı ve ardından, türe-özgü, hayvansal kaynaklı primer yakalama antikorları kullanılarak teyit edildi. herhangi bir antijene bağlı değildi dışında spesifik olmayan ölçmek için bir kontrol olarak, bir boncuk grubu diğerlerine aynı işleme tabi tutuldu. antijen bağlı olan ve kontrol tanesi, daha sonra akış sitometrisi ilkelerine göre yüksek bir verim Analyzer üzerinde ölçülen, ileriye yönelik olarak toplanan, insan tükürük numuneleri ile inkübe edilmiştir, ve her bir antijene karşı antikorlar, ortalama florasan yoğunluğu birimleri (MFI) ölçüldü . Bu multipleks immunoassay daha az numune ile daha fazla veri içeren avantajlar, bir numarası vardır; azaltılmış maliyetler ve işçilik; ve yetenek ilgi birçok hedefleri tahlil özelleştirmek için. Sonuçlar tükrük çoklu bağışıklık especia olabilir, daha önceki maruz ve enfeksiyonları belirleme yeteneğine sahip olabileceğini göstermektedirBüyük insan topluluklarını kapsayan gözetim çalışmalarında Lly faydalıdır.
Introduction
Ishal ilişkili hastalık seksen sekiz yüzde dünya çapında yaklaşık 1.5 milyon ölüme neden, kirli su insan maruz güvensiz gıda ve kötü sanitasyon / hijyen ile ilişkilidir, çoğunluğu çocuk 1 bulunmaktadır. Bu halk sağlığı yetkilileri ve politika yapıcılar için endişe önemli bir nedenidir. Su bazlı ve diğer çevresel patojenler ile ilişkili pozlama ve hastalıkları araştırmak için bir çaba, insan örneklerinde 2-4 antikorları ölçmek için bir multipleks immunoassay geliştirdi. Bu yöntem, bu patojenlere maruz kalma belirlemek ve daha iyi immunoprevalence ve olay enfeksiyonları tanımlamak için epidemiyolojik çalışmalar uygulanabilir.
Tükürük insan biyomarker araştırma için serum alternatif olarak önemli söz sahibidir. Tükürük kullanmanın avantajları arasında non-invaziv ve numune toplama, düşük maliyet kolaylığı vardır, ve numuneler kolayca çocukların 5-7 <alınabilir/ Sup>. Serum ve tükürük örnekleri H. karşı antikorlar için yoğun çalışmalar yapılmıştır pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumonia 12, hepatit virüsleri A ve C 13-14, Noroviruses 2-4,15, T. gondii 2-4, dang humması virüsü 16, insan bağışıklık eksikliği virüsü (HIV), 17 ve Escherichia coli O157: H7 18.
Bir çoklu immünolojik eş zamanlı olarak tek bir örnek hacmi içinde ve bir döngü veya çalışmasında çok analit analizi sağlar. C Çoklanmış antijenler jejuni, T. gondii, H. pylori, hepatit A virüsü, ve iki Noroviruses bir kullanarak bu patojenler, insan tükürük IgG 2-4 ve IgA 3,4 ve plazma IgG 2,3 antikor tepkilerini ölçmek için kullanılmıştırBoncuk esaslı çoklayıcı immüno. su, toprak ve gıda mikroplara maruz kalma epidemiyolojik çalışmalar ile birlikte kullanıldığında, bu çalışmada açıklanan testin tipi çevre patojenlerin neden olduğu enfeksiyonların anlayışı geliştirmek için değerli bilgiler verebilir. Ayrıca, bu tür çalışmalarda elde edilen tükürük antikor veriler risk değerlendirmesi modelleri 19-22 geliştirmek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu sonuçlar, çok katlı bir bağışıklık deneyi, immünopozitif ya immunonegative olan tükürük örnekleri arasında ayrım için yararlı olduğunu göstermektedir. immunopozitivitesi belirlemek için, tek bir kesim noktası ortalama artı tükürük örneklerinin her test kontrol Kuplajsız boncuk log dönüştürülmüş MFI yanıtları üç standart sapma hesaplanırken tarafından geliştirilmiştir. kesim noktası, ya bir tek ya da çok patojenlere maruz kalma ve immunoprevalence değerlendirme yeteneği el…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clarissa Curioso was supported through an appointment to the Research Participation Program at the U.S. Environmental Protection Agency administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education through an interagency agreement between the U.S. Department of Energy and U.S. EPA.
Materials
| Equipment and Software | |||
| Microcentrifuge | Thermo Electron Corporation | 75002446 | Used to centrifuge samples |
| Vortex Mixer | VWR | G560 | Used to mix samples |
| Sonicator (mini) | Fisher Scientific | 15-337-22 | Used to separate beads |
| Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. | Capp | Various | |
| Hemacytometer (Bright Line) | Housser Scientific | 3200 | Used to count coupled beads |
| Multiscreen Vacuum Manifold | Millipore | MSVMHTS00 | Used in washing steps to remove supernatant |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | Used to agitate beads during incubations |
| Tube rack (1.5mL and 0.5mL) (assorted) | VWR | 30128-346 | |
| Weighing Scale | Mettler or other | Used to measure wash reagents for making buffers | |
| Dynabead Sample Mixer | Invitrogen | 947-01 | Used during coupling incubation step |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | Used to analyze antibody response data | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | Used to analyze antibody response data | |
| Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | Instrument and software used to run assay |
| Antigens | |||
| GI.1 Norwalk Virus : p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| GII.4 Norovirus VA387 : p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| Hepatitis A Virus : grade II concentrate from cell culture | Meridian Life Sciences | 8505 | Antigen coupled at 100 µg |
| Helicobacter pylori : lysate | Meridian Life Sciences | R14101 | Antigen coupled at 25 µg |
| Toxoplasma gondii : recombinant p30 (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | Antigen coupled at 25 µg |
| Campylobacter jejuni : heat killed whole cells | KPL | 50-92-93 | Antigen coupled at 50 µg |
| Primary Antibodies | |||
| Guinea pig anti-Norovirus | (CCHMC)* | NA | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori | KPL | 01-93-94 | Used for coupling confirmation |
| Goat pAb to Toxoplasma gondii | Abcam | Ab23507 | Used for coupling confirmation |
| BacTrace Goat anti-Campylobacter species | KPL | 01-92-93 | Used for coupling confirmation |
| Secondary Antibodies | |||
| Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson | 705-065-149 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) | KPL | 16-13-06 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) | KPL | 16-18-06 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | KPL | 176-1506 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Human IgG(ᵞ) | KPL | 16-10-02 | Used for Salivary Immunoassay |
| Consumables | |||
| 1.5 mL copolymer microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | Used as low binding microcentrifuge tubes |
| 10 µL pipette tip refills | BioVentures | 5030050C | |
| 200 µL pipette tip refills | BioVentures | 5030080C | |
| 1000 µL pipette tip refills | BioVentures | 5130140C | |
| Aluminum foil | Various Vendors | Used keep beads in the dark during incubations | |
| Deep Well plates | VWR | 40002-009 | Used for diluting saliva samples |
| Multiscreen Filter Plates | Millipore | MABVN1250 | Used to run assays |
| Oracol saliva collection system | Malvern Medical Developments Limited | Used for saliva collection | |
| Reagents | |||
| Carboxylated microspheres (beads) | Luminex Corporation | Dependent on bead set | Antigens are coupled to the microspheres |
| EDC (1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) | Pierce | 77149 or 22980 | Used in bead activation |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Pierce | 24510 | Used in bead activation |
| Steptavidin-R-phycoerythrin (1mg/mL) | Molecular Probes | S-866 | Used as reporter |
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | M-2933 | Used for coupling |
| Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) | Sigma | P-9416 | Used in wash buffer to remove non-specific binding |
| Protein Buffers | |||
| PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl |
| BSA | Sigma | A-7888 | 0.1% (w/v) |
| Tween-20 | Sigma | P-9416 | 0.2% (v/v) |
| Sodium Azide (0.05% azide)** | Sigma | S-8032 | **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws. |
| MES/ Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0) | |||
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, 1% BSA, pH 7.4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA |
| Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) | Sigma | S-3139 | 0.1M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN |
References
- Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. . Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , (2008).
- Augustine, S., et al. Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens. J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).
- Griffin, S., et al. Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers. J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).
- Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens. J Immunol Methods. 364 (1-2), 83-93 (2011).
- Ferguson, D. Current diagnostic uses of saliva. J Dent Res. 66, 420-424 (1987).
- Mandel, I. The diagnostic uses of saliva. J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).
- Malamud, D. Saliva as a Diagnostic Fluid. Brit Med J. 305, 207-208 (1992).
- Ballam, L., et al. Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection. J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).
- Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum. Malar J. 10, 104 (2011).
- Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies. J Clin Microbiol. 38 (6), 2344-2347 (2000).
- Toyoguchi, A., et al. Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection. J Vet Med Sci. 62 (11), 1231-1234 (2000).
- Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants. J Infect Dis. 182 (4), 1260-1263 (2000).
- Tourinho, R., et al. Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay. J Virol Methods. 173 (2), 169-174 (2011).
- Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies. Indian J Med Microbiol. 26 (4), 327-332 (2008).
- Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1028-1034 (2004).
- Yap, G., Sil, B., Ng, L. Use of saliva for early dengue diagnosis. PLoS Negl Trop Dis. 5 (5), e1046 (2011).
- Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus. Clin Diagn Lab Immunol. 6 (4), 577-580 (1999).
- Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS. J Med Microbiol. 52 (Pt 7), 569-572 (2003).
- Ashbolt, N., Bruno, M. Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia. J Water Health. 1 (3), 125-131 (2003).
- Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse. Water Sci Technol. 50 (2), 23-30 (2004).
- Ashbolt, N. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology. 198 (1-3), 229-238 (2004).
- Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids. Risk Anal. 24, 221-236 (2004).
- Wade, T. J., et al. . Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011. , (2011).
- Fujii, Y., et al. Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models. PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040 (2014).
- Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model. Vaccine. 26 (34), 4403-4409 (2008).
- Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century. Epidemiol Infect. 134 (6), 1303-1312 (2006).
- Baughman, A., et al. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1045-1053 (2004).
- Clotilde, L., Bernard, C., Hartman, G., Lau, D., Carter, J. Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods. J Food Prot. 74 (3), 373-379 (2011).
- . . Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2. 3, 6-102 (2014).
- Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).
