The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.
Adoptieve overdracht van ex vivo geëxpandeerde autologe tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL's) kunnen duurzaam en volledige reacties bij belangrijke subgroepen van patiënten met metastatische melanoom bemiddelen. Grootste obstakels van deze aanpak zijn de verminderde levensvatbaarheid van de overgedragen T-cellen, veroorzaakt door telomeerverkorting, en het beperkte aantal van TIL's verkregen van patiënten. Minder gedifferentieerde T-cellen met lange telomeren zou een ideale T cel subsets voor adoptieve T-celtherapie, maar genereren van grote aantallen van deze minder gedifferentieerde T-cellen is problematisch. Deze beperking van adoptieve T cel therapie kan in theorie worden overwonnen door het gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs), die zichzelf vernieuwen, te behouden pluripotentie, hebben langwerpige telomeren, en zorgen voor een onbeperkte bron van autologe T-cellen voor immunotherapie. Hier presenteren we een protocol om iPSCs behulp van Sendai-virus vectoren voor de transductie van herprogrammering factoren in TIL te genereren. Dit protocol genererens volledig geherprogrammeerd, vector-vrije klonen. Deze TIL-afgeleide iPSCs zou kunnen minder gedifferentieerde patiënt- en tumor-specifieke T-cellen voor adoptieve T-celtherapie te genereren.
Cellulaire herprogrammering technologie die generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) maakt het mogelijk via overexpressie van een gedefinieerde set van transcriptiefactoren houdt grote belofte in het gebied van cel-gebaseerde therapieën 1,2. Deze iPSCs vertonen transcriptie en epigenetische kenmerken en hebben de capaciteit voor zelf-vernieuwing en pluripotentie, net als embryonale stamcellen (SER) 3-5. Opmerkelijke vooruitgang geboekt bij het herprogrammeren technologie de afgelopen tien jaar heeft ons toegelaten om de menselijke iPSCs zelfs van terminaal gedifferentieerde cellen, zoals T-cellen 6-8 te genereren. T-cellen afgeleide iPSCs (TiPSCs) behouden dezelfde herschikte configuratie van T-celreceptor (TCR) ketengenen de oorspronkelijke T-cellen, die regeneratie van antigenspecifieke T-cellen van TiPSCs 9-11 toelaat.
Bijna 80% van melanoom infiltrerende lymfocyten (TIL's) verkregen uit een patiënt de tumor specifieke wijze tumor-geassocieerde antigenen eennd handhaven cytotoxiciteit tegen de oorspronkelijke kankercellen 12. Met name de expressie van geprogrammeerde celdood eiwit-1 (PD-1) op TIL bleek de autologe tumor-reactieve repertoire te identificeren, inclusief gemuteerd neoantigeen-specifieke CD8 + lymfocyten 13. Adoptieve overdracht van ex vivo geëxpandeerde autologe TIL's in combinatie met preparatieve lymphodepleting regimes en systemische toediening van interleukine-2 (IL-2) kunnen aanzienlijke regressie van metastatische melanoom veroorzaken subgroepen van patiënten 14. Ondanks bemoedigende resultaten in preklinische modellen en patiënten, slechte overleving van T-cellen toegediend en het bestaan van immuunonderdrukkende paden lijken het volledige potentieel van adoptieve T-celtherapie compromitteren. Huidige klinische protocollen vereisen uitgebreide ex vivo manipulatie van autologe T-cellen om grote aantallen te verkrijgen. Dit resulteert in de vorming van terminaal gedifferentieerde T-cellen die slechte overleving, verminderde Proliferative capaciteit en hoge PD-1 15.
Deze beperking van adoptieve T-celtherapie kan theoretisch worden overwonnen door iPSCs dat een onbeperkte bron van autologe T-cellen voor immunotherapie kan bieden. We hebben onlangs gemeld herprogrammering van melanoom TIL die hoge niveaus van PD-1 van Sendaivirus (SeV) gemedieerde transductie van de vier transcriptiefactoren, Oct3 / 4, SOX2, KLF4 en c-MYC 16. Hoewel retrovirusvectoren integratie in gastheerchromosomen eisen herprogrammering genen tot expressie, SeV vectoren zijn niet-integrerende en worden uiteindelijk verwijderd uit het cytoplasma. Herprogrammering efficiëntie is veel hoger bij een SeV systeem in vergelijking met lentivirus of retrovirus vectoren 6-8. Bovendien SeV kan herprogrammeren specifiek T-cellen in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC's), terwijl sommige iPSC klonen gegenereerd door lentivirus of retrovirus vectoren kunnen worden van nonlymphoid lijnen 6-8. Hier hebben we detailde procedures toegepast voor de isolatie en activatie van humane melanoom TIL en voor het genereren van TIL afkomstige iPSCs met een SeV herprogrammering systeem.
Hier hebben we aangetoond een protocol voor het herprogrammeren van melanoom TIL te iPSCs door SeV gemedieerde transductie van de vier transcriptiefactoren Oct3 / 4, SOX2, KLF4, en c-MYC. Deze benadering, met een SeV systeem om T-cellen te herprogrammeren, biedt het voordeel van een niet-integratiemethode 7.
Een eerdere studie toonde aan dat SeV herprogrammering systeem is zeer efficiënt en betrouwbaar niet alleen fibroblasten maar ook perifeer bloed T-cellen 7,17 herp…
The authors have nothing to disclose.
We thank Ms. Deborah Postiff and Ms. Jackline Barikdar in the Tissue Procurement Core and Dr. Cindy DeLong in the Pluripotent Stem Cell Core Laboratory at the University of Michigan for her technical assistance. This study was supported by University of Michigan startup funding and grants from the Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance, and NIH/NCI (1K08CA197966-01) to F. Ito.
gentle MACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
gentle MACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
RPMI 1640 | Life technologies | 11875-093 | |
Falcon 70 um Cell Strainer | BD | 352350 | |
BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes | BD | 352070 | |
IMDM | Life technologies | 12440053 | |
human AB serum | Life technologies | 34005100 | |
L-glutamine (200mM) | Life technologies | 25030-081 | |
2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) | Life technologies | 21985-023 | |
Penicillin-Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
gentamicin | Life technologies | 15750-060 | |
Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
D-PBS (-) | Life technologies | 14040-133 | |
recombinant human (rh) IL-2 | Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc. | ||
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 555329 | |
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | |
X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
FBS | Gibco | 26140-079 | |
HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
N-Acetylcysteine | Cumberland Pharmaceuticals Inc. | NDC 66220-207-30 | |
Falcon Tissue Culture Plates (6-well) | Corning | 353046 | |
Falcon Tissue Culture Plates (24-well) | Corning | 353047 | |
Sendai virus vector | DNAVEC | ||
SNL feeder cells | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
mitomycin C | SIGMA | M4287 | soluble in water (0.5 mg/ml) |
gelatin | SIGMA | G1890 | |
Primate ES Cell Medium | Reprocell | RCHEMD001 | warm in 37 ℃ water bath before use |
basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life technologies | PHG0264 | |
ReproStem | Reprocell | RCHEMD005 | warm in 37 ℃ water bath before use |