Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da melanoma umano Linfociti infiltranti il tumore
Summary
The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.
Abstract
Trasferimento adottivo di ex vivo ampliato linfociti tumore-infiltranti autologhe (TIL) possono mediare le risposte durature e completi in sottogruppi significativi di pazienti con melanoma metastatico. I principali ostacoli di questo approccio sono la ridotta vitalità delle cellule T trasferiti, causate da accorciamento dei telomeri, e il numero limitato di TIL ottenuti da pazienti. Le cellule T Meno dissociati con telomeri lunghi sarebbe un sottoinsieme di cellule T ideale per la terapia delle cellule T adottiva, tuttavia, generando un gran numero di queste cellule T meno dissociati è problematico. Questa limitazione della terapia con cellule T adottiva può essere teoricamente superata dalle cellule utilizzando indotte pluripotenti staminali (iPSCs) che l'auto-rinnovarsi, mantenere i telomeri pluripotenza, si sono allungati, e di fornire una fonte illimitata di cellule T autologhe per l'immunoterapia. Qui, vi presentiamo un protocollo per generare iPSCs utilizzando vettori di virus Sendai per la trasduzione di fattori di riprogrammazione in TIL. Questo protocollo generas completamente riprogrammati, cloni libero da vettori. Questi iPSCs TIL-derivati potrebbero essere in grado di generare cellule T-paziente e tumore-specifici meno dissociati per la terapia delle cellule T adottiva.
Introduction
La tecnologia di riprogrammazione cellulare che permette la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) mediante la sovraespressione di un insieme definito di fattori di trascrizione promette grandi sviluppi nel campo delle terapie a base di cellule 1,2. Queste iPSCs presentano caratteristiche trascrizionali ed epigenetici e hanno la capacità di auto-rinnovamento e pluripotenza, analogamente alle cellule staminali embrionali (ESC) 3-5. Notevoli progressi realizzati nella tecnologia di riprogrammazione negli ultimi dieci anni ci ha permesso di generare iPSCs umani anche da cellule terminalmente differenziate, come le cellule T 6-8. IPSCs derivati dalle cellule T (TiPSCs) mantengono la stessa configurazione riarrangiato di recettore delle cellule T (TCR) geni catena come le celle originali T, che permette la rigenerazione delle cellule T antigene-specifiche da TiPSCs 9-11.
Quasi l'80% dei linfociti melanoma infiltranti (TIL) ottenuto da tumore di un paziente specificamente riconoscere tumore-antigeni associati aND mantenere la citotossicità contro le cellule tumorali originali 12. In particolare, l'espressione della morte cellulare programmata proteina-1 (PD-1) sul TIL è stato trovato per identificare il repertorio tumore-reattiva autologo, compresi mutato specifico neoantigene CD8 + linfociti 13. Trasferimento adottivo di ex-vivo TIL autologhe espanse in combinazione con regimi lymphodepleting di preparazione e somministrazione sistemica di Interleuchina-2 (IL-2) può causare sostanziale regressione del melanoma metastatico in sottogruppi di pazienti 14. Nonostante gli incoraggianti risultati in modelli preclinici e nei pazienti, scarsa sopravvivenza delle cellule T infuse e l'esistenza di percorsi immunosoppressivi sembrano compromettere il pieno potenziale della terapia con cellule T adottiva. Protocolli clinici attuali richiedono ampie ex vivo manipolazione di cellule T autologhe per ottenere grandi numeri. Il risultato è la generazione di cellule terminalmente differenziate T che hanno scarsa sopravvivenza, ridotto Prolla capacità iferative, e alti livelli di PD-1 15.
Questa limitazione della terapia con cellule T adottiva può essere teoricamente superato utilizzando iPSCs che possono fornire una fonte illimitata di cellule T autologhe per l'immunoterapia. Abbiamo recentemente riportato la riprogrammazione del melanoma TIL esprimere alti livelli di PD-1 dal virus di Sendai (SeV) trasduzione mediata dei quattro fattori di trascrizione, Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc 16. Mentre vettori retrovirali richiedono l'integrazione in cromosomi di accoglienza per esprimere geni riprogrammazione, vettori Sev sono non-integrazione e sono poi eliminati dal citoplasma. La riprogrammazione efficienza è molto più alto con un sistema SeV rispetto lentivirus o retrovirus vettori 6-8. Inoltre, SeV possono specificatamente riprogrammare le cellule T nelle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC), mentre alcuni cloni IPSC generati da lentivirus o vettori retrovirali possono essere da lignaggi nonlymphoid 6-8. Qui, abbiamo dettagliole procedure implementate per l'isolamento e l'attivazione di melanoma umano TIL e per la generazione di iPSCs TIL derivati utilizzando un sistema di riprogrammazione SeV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, abbiamo dimostrato un protocollo per la riprogrammazione TIL melanoma a iPSCs da trasduzione SEV-mediata dei quattro fattori di trascrizione Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc. Questo approccio, utilizzando un sistema SeV per riprogrammare cellule T, offre il vantaggio di un metodo non integrare 7.
Uno studio precedente ha mostrato che un sistema riprogrammazione SeV era altamente efficiente e affidabile per riprogrammare fibroblasti non solo, ma anche le cellule T del sangue peri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ms. Deborah Postiff and Ms. Jackline Barikdar in the Tissue Procurement Core and Dr. Cindy DeLong in the Pluripotent Stem Cell Core Laboratory at the University of Michigan for her technical assistance. This study was supported by University of Michigan startup funding and grants from the Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance, and NIH/NCI (1K08CA197966-01) to F. Ito.
Materials
| gentle MACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentle MACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| RPMI 1640 | Life technologies | 11875-093 | |
| Falcon 70 um Cell Strainer | BD | 352350 | |
| BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes | BD | 352070 | |
| IMDM | Life technologies | 12440053 | |
| human AB serum | Life technologies | 34005100 | |
| L-glutamine (200mM) | Life technologies | 25030-081 | |
| 2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) | Life technologies | 21985-023 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| gentamicin | Life technologies | 15750-060 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
| D-PBS (-) | Life technologies | 14040-133 | |
| recombinant human (rh) IL-2 | Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc. | ||
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 555329 | |
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Cumberland Pharmaceuticals Inc. | NDC 66220-207-30 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (6-well) | Corning | 353046 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (24-well) | Corning | 353047 | |
| Sendai virus vector | DNAVEC | ||
| SNL feeder cells | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
| mitomycin C | SIGMA | M4287 | soluble in water (0.5 mg/ml) |
| gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Primate ES Cell Medium | Reprocell | RCHEMD001 | warm in 37 ℃ water bath before use |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life technologies | PHG0264 | |
| ReproStem | Reprocell | RCHEMD005 | warm in 37 ℃ water bath before use |
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