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Environment

Extraction et analyse des acides gras des phospholipides microbiens dans les sols

Published: August 26, 2016
doi:
10.3791/54360
, , , , ,
1Department of Renewable Resources,University of Alberta, 2Department of Science, Augustana Faculty,University of Alberta, 3Laboratoire Génie Civil et géo-Environnement,Université de Lille, 4Department of Earth and Environmental Sciences,Mount Royal University, 5Forest Ecology & Production, Great Lakes Forestry Centre,Natural Resources Canada

Summary

les acides gras phospholipides fournissent des informations sur la structure des communautés microbiennes du sol. Nous présentons des procédés pour l'extraction d'échantillons de sol avec un mélange à une seule phase de chloroforme, le fractionnement des lipides extraits en utilisant des colonnes d'extraction en phase solide et méthanolyse pour produire des esters méthyliques d'acides gras, qui sont analysées par chromatographie en phase gazeuse capillaire.

Abstract

les acides gras des phospholipides (AGPL) sont des éléments clés des membranes cellulaires microbiennes. L'analyse des AGPL extraites des sols peut fournir des informations sur la structure globale des communautés microbiennes terrestres. PLFA profilage a été largement utilisé dans une variété d'écosystèmes comme un indice biologique de la qualité globale du sol, et comme un indicateur quantitatif de la réponse du sol à la gestion et d'autres facteurs de stress environnementaux terre.

La méthode standard présentée ici décrit quatre étapes clés: 1. l'extraction des lipides à partir d'échantillons de sol avec un mélange de chloroforme monophasé, 2. fractionnement en utilisant des colonnes d'extraction en phase solide pour isoler les phospholipides d'autres lipides extraits, 3. méthanolyse des phospholipides pour produire l'acide gras esters méthyliques (FAME), et 4. L'analyse FAME par chromatographie en phase gazeuse capillaire en utilisant un détecteur à ionisation de flamme (GC-FID). Deux normes sont utilisées, y compris le 1,2-dinonadecanoyl- sn – glycéro-3-phosphocholine (PC (19:0/19: 0)) pour évaluer le recouvrement global du procédé d'extraction, et le décanoate de méthyle (MeC10: 0) comme étalon interne (ISTD) pour l'analyse par GC.

Introduction

Les acides gras de phospholipides (de AGPL) font partie des membranes cellulaires microbiennes des domaines bactéries et eucaryotes. AGPL microorganismes produisent de différentes longueurs de chaîne et de la composition en tant que moyen pour maintenir l'intégrité de la membrane cellulaire et la fonction cellulaire en réponse à des conditions d'environnement immédiat; par conséquent, on peut affirmer que les communautés microbiennes qui sont séparées géographiquement, mais sont soumis à des conditions de sol similaires expriment AGPL similaires. AGPL de sol avec une longueur de chaîne entre 14 et 20 atomes de carbone sont généralement considérés comme étant d'origine bactérienne et fongique principalement 1. Dans les cultures mixtes, l'analyse PLFA ne peut pas être utilisé pour identifier les espèces microbiennes individuelles, mais il peut fournir une empreinte globale des communautés microbiennes trouvées dans les sols. En outre, depuis AGPL sont rapidement dégradées lors de la mort cellulaire, ils peuvent être considérés comme représentatifs de la communauté microbienne du sol viable 2. Cette technique a été largement utilisée pour caractériser la composition structurelle des communautés microbiennes trouvées dans une large gamme d'environnements, allant des forêts 3-4 à 5-6 prairies et les champs agricoles 7. Elle a été appliquée avec succès pour caractériser la réponse du sol à la terre des changements de gestion, y compris les forêts claires de coupe 8, chaulage 9, remise en état ​​10-12, ainsi que des troubles tels que le feu 13, la contamination par les métaux 14 et des hydrocarbures 15, et à l' apparition d' insectes 16 .

La méthode analytique PLFA contemporaine a évolué au cours des six dernières décennies, grâce à plusieurs avancées clés par un certain nombre de groupes de recherche. En 1958, une amélioration significative est née de l' ajustement du chloroforme: methanol: eau dans le rapport de la solution d'extraction pour déplacer le mélange d'un monophasique à un système diphasique 17. Cette extraction lipidique optimisée et le pro d'isolement révisétocol est devenu connu comme la méthode de Bligh et Dyer. Le protocole a été adopté par de nombreux laboratoires au cours des prochaines décennies et, pendant ce temps, White et ses collègues ont contribué à des avancées significatives de la méthode; par exemple, ils ont amélioré l'étape d'extraction par échange d'un tampon phosphate pour l'eau, et ils ont optimisé l'analyse par chromatographie en phase gazeuse (GC) grâce à une meilleure identification des pics et la quantification. Peut-être plus pertinentes à la science du sol, ils ont déterminé en 1979 que les lipides extraits pourraient être utilisés comme un indice de la structure microbienne quand ils ont examiné la biomasse microbienne des sédiments marins 18.

D' autres développements ont eu lieu dans les années 1980 que la méthode est devenue plus largement utilisé dans la science du sol, en particulier par rapport à la rhizosphère 19. A cette époque, le procédé comprend nonadecanoate de méthyle (MeC19: 0) comme étalon interne et 19 l'utilisation d'une colonne d'acide silicique pour le fractionnement des lipides 21 </ Sup>. Après son travail avec Blanc 19,21, Tunlid retourna en Suède et a commencé la recherche en collaboration avec Bååth et Frostegård. En examinant l'efficacité des différents tampons d'extraction pour une série de sols variant la teneur en matière organique, le groupe a montré que le tampon citrate a augmenté la quantité de phosphate de lipides extraits par rapport au tampon phosphate 22. En outre, leur publication 23 sur l'influence du chaulage sur les communautés microbiennes du sol 1993 est devenu un classique de citation en biologie du sol et biochimie 24. Les chercheurs ont utilisés analyse des composantes principales dans le traitement de leurs données. analyse PLFA, comme la méthode est maintenant appelée, génère de grands ensembles de données et l'utilisation des procédures statistiques multivariées pour traiter ces données était très novateur pour l'époque et une source d'inspiration pour beaucoup. En même temps le travail se fait en Suède, des modifications à la procédure PLFA ont été étudiés dansAllemagne par Zelles et ses collègues 25-26. Leur version de la procédure a été marquée par son utilisation d'une colonne (SPE) d'extraction en phase solide au lieu de la colonne d'acide silicique, mais, dans l'ensemble, était plus intensive en laboratoire.

Le document de Frostegård 23, ainsi que la méthodologie détaillée par White & Ringelberg 27, a jeté les bases d'une explosion dans l'utilisation de la technique PLFA pour enquêter sur des questions fondamentales de la science du sol. Depuis lors, d' autres améliorations de la méthode par Firestone et ses collègues ont inclus l' ajout d' une norme GC interne (C10: 0) et C19: 0 en tant que norme de substitution pour améliorer la quantification 28, et remplacer l'utilisation de décanter entonnoirs pour les flacons à fond rond pour simplifier extraction 29. Plus récemment, Chowdhury et Dick 30 ont étudié l'étape de méthylation et ont rapporté que des deux procédures de méthylation utilisés dans la littérature de science du sol la méthode KOH / MeOH identified un plus grand nombre d'acides gras.

La méthode présentée est en grande partie basée sur la méthode originale développée par Bligh et Dyer, et intègre les modifications mentionnées ci-dessus, tels que l'utilisation de KOH méthanolique pour l'étape de méthylation. Deux étalons sont utilisés pour chaque échantillon: une norme de substitution de 1,2-sn – glycéro dinonadecanoyl–3-phosphocholine (PC (19: 0/19: 0)), qui est ajoutée à l'échantillon de sol avant la première extraction pour évaluer l'efficacité et la récupération de l'ensemble du protocole, et à un niveau d'instrument de décanoate de méthyle (MeC10: 0), qui est ajoutée avant l'identification et la quantification par CG.

Nous reconnaissons que la méthode PLFA est couramment utilisé par de nombreux laboratoires d'écologie microbienne dans le monde entier, et a été documentée à plusieurs reprises, y compris par l'Organisation internationale de normalisation 2. L'objectif de cet article est de présenter un facile à suivre et robuste protocole qui peut être utile dans le solles scientifiques qui tentent d'apprendre la technique PLFA.

Protocol

REMARQUE: Assurez-vous toujours que l'équipement de protection individuelle (EPI) est porté à travers le protocole. La verrerie doit pas être touché avec les mains nues. Lipides de doigts, les cheveux, la graisse, les huiles et les hydrocarbures sont tous les contaminants potentiels. Toujours porter des gants en nitrile et des gants de rinçage avec 70% d'alcool lors de la manipulation de la verrerie propre. 1. Préparation de la verrerie pour l'analyse Verrerie jetable (par exemple, des tubes de centrifugeuse) Envelopper dans une feuille d'aluminium et de la chaleur dans le moufle pour quatre heures et demie à 450 ºC. Polytétrafluoroéthylène (PTFE) -Doublés caps Faire tremper bouchons pendant une heure dans un détergent phosphate, puis laver avec brosse dans l'eau chaude et du détergent phosphate. Rincez le savon avec de l'eau du robinet. Placer dans un bain d'acide (HCl à 5%) pendant une heure seulement (ne pas laisser plus longtemps que les doublures peuvent tomber des bouchons si elles sont trempées pendant trop longtemps. Rincer trois foisdans l'eau du robinet. Rincer trois fois dans l'eau distillée. Sécher au four à 40 ºC. La verrerie (par exemple, 10 ml, 15 ml, 45 ml flacons / bocaux) Laver avec brosse dans l'eau chaude et du détergent phosphate. Rincez le savon avec de l'eau du robinet et placer dans un bain d'acide (HCl 5%) de nuit. Rincer trois fois dans l'eau du robinet, puis rincer trois fois dans l'eau distillée et puis sécher au four à 40 ºC. Envelopper dans du papier d'aluminium propre (50 ml pots sont emballés individuellement et d' autres objets en verre est enveloppé dans des lots d'échantillons, par exemple, 20) et de la chaleur dans le moufle pour quatre heures et demie à 450 ºC. Verrerie volumétrique (par exemple, fiole jaugée) Laver avec brosse dans l'eau chaude et du détergent phosphate. Rincez le savon avec de l'eau du robinet et placer dans un bain d'acide (HCl 5%) de nuit. Rincer trois fois dans l'eau du robinet, rincer trois fois dans l'eau distillée, puis sécher au four à 40 &# 186; C. Avant utilisation rincer 3 fois avec une petite quantité de solvant (par exemple, le méthanol) – Ne pas mettre la verrerie volumétrique dans le four à moufle. 2. Collecte et traitement des échantillons de sol avant l'analyse PLFA Recueillir des échantillons de sol dans des sacs stériles, et à moins que ceux-ci peuvent être analysés immédiatement, congelez-les dès que possible. Conserver les échantillons dans le congélateur (-80 ° C) jusqu'au moment de procéder à la lyophilisation des échantillons. Congeler des lots d'échantillons secs en suivant les instructions du lyophilisateur. Transférer chaque échantillon lyophilisé à nouveau marqué sac stérile. Peser l'échantillon de la matière lyophilisée dans un sac dans le tube de centrifugeuse assourdi pré-étiquetés pour l'extraction PLFA. NOTE: Une ligne directrice générale est d'utiliser 0,5 g de matières organiques (teneur en carbone> 17% wt) et jusqu'à 3,0 g pour les échantillons de sol minéral. poids de l'échantillon d'enregistrement pour chaque échantillon. Pour tous les 10 échantillons, peser également undeux exemplaires supplémentaires pour l' analyse, ainsi que pour tous les 20 échantillons comprennent un flan ( à savoir, un tube de centrifugeuse qui ne dispose pas d' échantillon dedans – utilisé comme témoin pour identifier toute contamination au cours du processus d'extraction AGPL). lots de processus des tubes d'échantillons en même temps. NOTE: Un ensemble de 20 échantillons correspond à un lot de 23 tubes d'échantillons (échantillons 1 à 10, un double de l'échantillon 10, des échantillons 12 à 22, un duplicata de l'échantillon 22, et un blanc = lot de 23 tubes d'échantillons). REMARQUE: Procéder à l'extraction, puis la séparation, puis la méthylation dans des lots d'échantillons avant de les préparer pour l'analyse de GC et tous courir ensemble. Cela permet d'identifier où les erreurs se sont produites si quelque chose se passe mal, et peut aider à réduire le nombre d'extractions répétées nécessaires. 3. PLFA Technique (étapes sont pour échantillon individuel mais complet tout un lot à la fois) NOTE: Toutes les étapes de la technique PLFA décrits dans les étapes1-3 ci-dessous devrait être effectuée dans une hotte en utilisant des EPI appropriés et en suivant les directives de sécurité en laboratoire. Extraction (Etape 1): Préparer 5,0 M KOH en dissolvant 14 g de KOH dans 50 ml d' eau distillée, l' eau déminéralisée (dH 2 O). Préparer un tampon de citrate 0,15 M en dissolvant de l' acide citrique , 31,52 g de monohydrate dans 400 ml de dH 2 O. Ajuster le pH à 4,00 ± 0,02 en ajoutant 5,0 M KOH; environ 45-50 ml de 5,0 M KOH seront nécessaires pour ajuster le pH à 4,00. Quand on ajuste le pH, on dilue un tampon citrate à 1000 ml en utilisant une fiole jaugée. Rangez tampon citrate dans le réfrigérateur lorsqu'ils ne sont pas en cours d'utilisation (jusqu'à un mois). Préparer tous les jours le PC (19: 0/19: 0) norme de substitution nonadecanoate en diluant 250 pi de la solution mère (10 mg / ml) dans 25 ml de chloroforme (cela donne suffisamment la norme de substitution pour un lot de 23 échantillons). Ajouter 0,5 ml de PC (19: 0/19: 0) solution étalon de substitution pour le tube échantillon de centrifugeuse. UNEdd l'extractant Bligh et Dyer à l'échantillon de sol dans l'ordre suivant: i) 2,0 ml de tampon citrate, ii) de 2,5 ml de chloroforme, et iii) 5,0 ml de méthanol. échantillon de Cap avec un capuchon en PTFE doublé et vortex pendant 30 sec; placer dans un shaker de bout en bout sur pendant 2 heures. Centrifuger à 226 g pendant 15 min avec bouchon. Dessinez surnageant avec une pipette Pasteur et le transfert à un 45 ml flacon de verre marqué. Ajouter un second tour de Bligh et Dyer extractant à chaque échantillon, et répétez les étapes 4 et 5 ci-dessus. Dessinez surnageant avec une pipette Pasteur et le transfert à la même marqué 45 ml flacon en verre. Ajouter à 45 ml étiqueté flacon en verre contenant le surnageant: i) 5,0 ml de chloroforme, et ii) un tampon de 5,0 ml de citrate. Cap blanc chapeau et vortex verre revêtu PTFE flacon pendant 30 secondes. Laisser reposer une nuit à température ambiante dans l'obscurité (pour éviter l'oxydation). aspirer avec précaution la phase aqueuse supérieure du flacon de 45 ml (si aucun vide est disponible, la pipette doit être abaissée à travers la aquela phase ous très soigneusement pour ne pas recueillir toute la pipette lors du pipetage de la phase organique). Pipette phase organique inférieure dans marqué 15 ml flacon. Placer lot de flacons 15 ml sous N2 comprimé (pour éviter l' oxydation) à température ambiante. S'évaporer lentement le chloroforme, le réglage du débit de N2 froisser la surface du liquide contenu dans le flacon , mais pas grimper sur les côtés du flacon. Visser le capuchon et stocker des échantillons revêtus de PTFE dans le congélateur à -20 ºC enveloppé dans une feuille d'aluminium (wrap par lots plutôt qu'individuellement) jusqu'à ce que prêt à passer à l'étape 2. Lipid fractionnement (étape 2) Placez support de colonne SPE avec tourillons sur le réservoir de verre. Insérez de nouvelles colonnes SPE (silice, 500 mg, 6 ml) dans tourillons. que nécessaire Label (recommandé pour éviter de mélanger des échantillons). Conditionner chaque colonne en ajoutant 5 ml d'acétone et laisser égoutter à travers, puis ajouter deux additions de 5 ml de chloroforme (volume total = 10 ml). Laisser deuxième lavage de chloroforme pour écouler jusqu'à ~ 1 mm au-dessus de la fritte puis fermer le robinet. Re-dissoudre l'échantillon (stocké dans 15 ml flacon à la fin de l'étape 1) en ajoutant 0,5 ml de chloroforme au flacon et le vortex doucement. l'échantillon à la colonne SPE en utilisant une pipette Pasteur, le transfert a été redissous; répéter pour un total de 2 transferts (volume de transfert total de 1 ml de chloroforme par échantillon). Lay échantillon lipidique directement dans le centre de la colonne et permettre au solvant de se vider complètement dans le réservoir. Éluer les lipides neutres par addition de 5 ml de chloroforme à chaque colonne. Laissez le solvant se vider complètement dans le réservoir. Éluer glycolipides en ajoutant 5 ml d'acétone à chaque colonne. Laissez le solvant se vider complètement dans le réservoir de collecte. Supprimer la colonne support du réservoir et vidanger le réservoir avec un appareil à vide. Insérez rack avec des tubes de centrifugeuse propres et étiquetés dans le réservoir. Remplacer la colonne support sur le réservoir; colonne intitulée ci-dessus doit être aligné avec centr marquéTube ifuge ci-dessous. Éluer phospholipides dans des tubes de centrifugeuse en ajoutant 5 ml de methanol à chaque colonne. Attendez colonnes SPE à sécher dans la hotte des fumées avant de les jeter. Fractions phospholipides vers le bas sec à température ambiante sous comprimé N 2. Tubes de purge avec N 2. Visser le capuchon et stocker des échantillons revêtus de PTFE dans le congélateur à -20 ºC enveloppés dans une feuille d'aluminium (wrap par lots plutôt qu'individuellement) jusqu'au moment de passer à l' étape 3. Lipide méthylation (étape 3). Allumez le bain d'eau chaude fixé à 37 ºC. Préparer l' acide acétique 1M (si pas déjà fait) en dissolvant 57,1 ml d' acide acétique glacial en 1000 de dH 2 O en utilisant un 1000 ml fiole jaugée. Cette solution peut être stockée à température ambiante pendant trois mois. . Préparer lot de KOH méthanolique. Préparer une solution 0,2 M de KOH par dissolution de 0,45 g de KOH dans 40 ml de methanol. Ajuster le volume de KOH et du methanol selon unla taille du lot nticipated à l'étape 3. Préparer cette solution quotidienne; ne pas stocker pendant de longues périodes. Retirer les échantillons (dans des tubes de centrifugeuse stockées après l'étape 2) du congélateur et laisser les échantillons revenir à température ambiante. Ajouter 0,5 ml de chloroforme et 0,5 ml de methanol à chaque échantillon, suivi par 1,0 ml de KOH méthanolique. tubes Cap étroitement avec bouchon PTFE doublé. Agiter pour mélanger. Placer les échantillons scellés dans 37 ºC bain pendant 30 min. Faire en sorte que le niveau d'eau est au minimum de 1 à 2 mm au-dessus du niveau du liquide échantillon. Retirer et laisser les échantillons refroidir. Alors que les échantillons sont en bain d'eau, étiqueter les petits flacons de verre avec ID d'échantillon (10 ml flacon en verre avec bouchon revêtu PTFE). Ajouter 2,0 ml d'hexane à chaque échantillon et faire tourbillonner. Ensuite, ajoutez 0,2 ml d'acide acétique 1,0 M à chaque échantillon et agiter pour mélanger à nouveau; séparation de phase doit devenir visible. Ajouter 2,0 ml de dH 2 O à chaque échantillon pour briser phase. échantillons Vortex pendant 30 secondes. Puis centrifuger les échantillons à 226 g pendant 2 min. En utilisantcourte pipette Pasteur, transférer la phase supérieure pour nettoyer étiqueté flacons de 10 ml. Veillez à ne pas transférer de la phase inférieure (aqueuse). Ajouter 2,0 ml d'hexane à chaque tube échantillon de centrifugeuse et agiter. échantillons Vortex pendant 30 secondes. Puis centrifuger les échantillons à 226 g pendant 2 min. Utilisation de courte pipette Pasteur, ajouter à nouveau la phase supérieure à la marqué flacon de 10 ml en verre. Évaporer le solvant dans 10 ml marqué-flacon en verre à température ambiante sous N2. Visser le capuchon et stocker des échantillons revêtus de PTFE dans le congélateur à -20 ºC enveloppé dans une feuille d'aluminium (wrap par lots plutôt qu'individuellement) avant d'être prêt à procéder à une analyse par GC. Assurez-vous d'étiqueter tous les échantillons. Chromatographe en phase gazeuse (GC) NOTE: Identification et quantification des AGPL individuels est accomplie en utilisant un GC connecté soit à un FID ou un détecteur MS. Bien que les instructions ci-dessous sont pour GC-FID, la préparation de l'échantillon serait valable pour GC-MS waune. Un exemple mis en place un système GC-FID comprendrait un 25 m × 0,2 mm × 0,33 um (5% -phényl) colonne -méthylpolysiloxane avec le protocole de température suivant: température initiale de 190 ° C, rampe 10 ºC / min à 285 ° C , maintenez 9,5 min, rampe de 60 ºC / min à 310 ° C, maintenez 0,42 min 31. Préparer l'étalon interne GC (ISTD) en ajoutant une goutte de MeC10: 0 (décanoate de méthyle) à 100 ml d'hexane (enregistrement a ajouté du poids à 0,1 mg). Mettez les gaz à GC et puis allumez le GC. Assurez – vous que H 2, N 2 et bouteilles d'air sont ouverts et qu'il ya suffisamment de gaz pour exécuter l'analyse (H 2 ne doit jamais descendre en dessous de 500 psi). Vérifier que les conditions d'un bon calibrage sont remplies en exécutant les normes de calibrage contenant un mélange d'acides gras, suivie d'une ébauche de l'hexane. Identité des acides gras individuels peut être manuellement attribué en fonction des comparaisons avec des temps de rétention obtenus pour les normes, ou cela peut être automatically affecté en utilisant commercialement logiciels disponibles 31. Dans tous les cas, l' identification univoque peut être réalisée à l' aide d' un détecteur MS 2. NOTE: Les autres signes d'un bon étalonnage comprennent une ligne de base plate et aucune contamination dans le rinçage à l'hexane. Dissoudre chaque résidu d'échantillon AGPL (contenu dans 10 ml flacon en verre de lipide méthylation de l'étape 3) dans 150 ul de la solution ISTD et transférer dans un GC flacon (en variante utiliser 50 à 75 ul si la réponse de l'échantillon est prévu pour être faible, comme très sols sableux). Réglez le volume d'injection d'échantillon à 2 pi. Réglez la température à 300 ° C FID. Exécuter les échantillons en utilisant une température d'entrée de 250 ° C, avec du H 2 comme gaz porteur (débit 1,3 ml / min) et un rapport de division de 30: 1.

Representative Results

Les acides gras sont désignés comme étant X: YωZ, où X représente le nombre d'atomes de carbone, Y représente le nombre de doubles liaisons, et Z indique la position de la première double liaison à partir de l'extrémité aliphatique (ω) de la molécule. c »Les suffixes et 't' indiquent les isomères cis et trans géométriques. Les préfixes et suffixes «a» et «i» se réfèrent à Anteiso et iso ramification et Moi et OH spécifier des groupes méthyle et les groupes hydroxyles, respectivement. run Post-GC, vérifier que les échantillons reçus adéquats ISTD en regardant le 10: 0 pic. Vérifiez également la réponse des normes du GC, à savoir, les flacons contenant de l' hexane avec une solution ISTD ajoutée; ceux-ci ne devraient pas avoir d'autres sommets. réponse standard interne devrait être similaire dans toutes les courses. La figure 1 présente une représentive exécution de l'échantillon. Le grand pic de solvant hexane apparaît de façon caractéristique à un temps de rétention (RT) d'environ 1,8 min. Le pic de l'étalon ISTD (C10: 0) apparaît à un RT de 3,4 min, tandis que C19: 0 a une RT de 16,2 min. L'analyse GC sépare les AGPL en fonction de leur longueur de chaîne avec des chaînes plus longues éluant plus lentement; par exemple, C18: 0 élue à 14,4 min en C16: 0 à 10.8 min élue. En outre, ce protocole analytique peut séparer AGPL en fonction de leur degré d'insaturation et la position de leur double liaison; par exemple, en C18: 0 à 14,4 éluée min, en C18: 1 9c, et C18: 1 7c éluer 14.0 et 14.1 min, respectivement (figure 1). Enfin, AGPL de même longueur de la chaîne et de la saturation , mais la configuration de branchement différente (anteiso par rapport iso) peuvent être séparés; Par exemple, C15 et C15 0i: 0a éluent à 8,6 et 8,7 min, respectivement (figure 1). Les zones des différents pics de GC peuvent être importés dans une feuille de calcul pour traiter en outre les informations de chromatographie en phase gazeuse. Chaque PLFA identifié est quantifiée (nmol g -1 de sol sec) en utilisant l'équation suivante: où F est un facteur d'ajustement qui tient compte de la FID sélectivité et les différences de molarité entre les acides gras 32, areaPLFA est la zone de pic pour chacun identifié PLFA, areaC10: 0 est la surface du pic pour le ISTD (MeC10: 0), C10: 0 std ajoutée est la quantité de ISTD (nmol) ajouté à chaque échantillon avant la course de GC, le rapport (C19: 0 std ajouté / C19: 0 échantillon) correspond à la récupération du PC (C19: 0 / C19: O) norme de substitution, et le poids de l'échantillon est la quantité de séché au four sol (g) ajouté au tube d'origine échantillon de centrifugeuse et utilisé pour extraire AGPL. NOTE: Les zones relevant de la différepics nt sont exprimés en zones de pointe, la réponse ou la réponse de% selon le système de GC. Dans la gamme pertinente dans le sol PLFA la caractérisation, les zones peuvent être supposées être linéairement proportionnel au poids des acides gras; En variante, de petits facteurs de correction peuvent être appliqués pour tenir compte de la sélectivité 32 FID. En outre, parce que les résultats sont d'abord exprimées sur une base de pour cent en poids, ils doivent être normalisées pour produire des quantités molaires. Ajustement pour tenir compte des différences de molarité est obtenue en tenant compte des poids moléculaires des acides gras individuels; tables publié 32 et logiciels commerciaux 31 sont également disponibles pour aider lors de la normalisation pour molarité. La quantité d'étalon interne (nmol) a été ajouté à chaque échantillon peut encore être calculée comme suit: C10: 0std ajouté = [ISTD] × V (STD ajouté) <p class="jove_content" fo:keep-together.wSEIN-page = "1"> où [ISTD] est la concentration (nmol -1 l) de la MeC10: 0 (décanoate de méthyle) dissous dans de l' hexane (voir étape 3.4.1) et V (STD ajouté) est le volume (l) de la solution préparée ISTD ajoutée à chaque échantillon avant la course de GC (c. -à- 150 pi selon l'étape 3.4.4). La quantité de C19: 0 (nmol) présent dans chaque échantillon en cours d'analyse par GC correspond à: où areaC19: 0 est l'aire du pic de C19: O, tandis que la quantité correspondante de C19: 0 (nmol) a été ajouté à chaque échantillon au début du procédé d'extraction AGPL (voir étape 3.1.3) est la suivante: où [19: 0] Std (mg L -1 </sup>) est la concentration du C19: 0 norme de substitution nonadecanoate dissous dans du chloroforme (étape 3.1.3), V (19: 0 std ajouté) est le volume de l' étalon de substitution préparé ajouté à chaque échantillon au début de l'extraction PLFA procédé (voir étape 3.1.3), M 19: 0 est le poids moléculaire de 1,2-sn – glycéro dinonadecanoyl–3-phosphocholine (PC (19: 0/19: 0)). Remarque: Une mole de C19: 0 nonadecanoate rendements standards de substitution de deux moles de C19: 0 après l'étape de méthylation, tandis que le C10: 0 standard est ajouté après méthylation. Les AGPL suivants sont généralement exclus de l'analyse des communautés microbiennes du sol: i) AGPL qui sont <14 C et> 20 C de longueur, et ii) AGPL avec moins de 0,5% du total dans la zone de pointe. Une fois que ces AGPL ont été exclus, les réponses de tous les AGPL restants peuvent être additionnés pour obtenir le bi totale PLFAomass (nmol g -1 de sol sec). L' analyse univariée des données AGPL (par exemple, ANOVA, après transformation , le cas échéant pour répondre aux hypothèses du test en cours d' exécution de données) peut être utilisé pour comparer la biomasse totale PLFA et / ou PLFA biomasse des groupes choisis parmi l' échantillon des groupes / traitements. Par exemple, la figure 2 présente les résultats pour la distribution relative des différents groupes de AGPL, tels que les AGPL saturés à chaîne droite, AGPL saturés soit à mi-chaîne (10-méthyle) ou la ramification terminale et de mono- ou AGPL poly – insaturés, ainsi que la somme des AGPL totaux (nmol g -1 de sol sec). Dans cet exemple particulier, l'âge des arbres (qui diminue à partir du site 1 au site 3) est considéré à influencer les AGPL totales et la répartition relative des différents groupes de AGPL. Pour évaluer les tendances générales dans la composition PLFA parmi les échantillons, l'analyse multivariée de tous les AGPL peut être ConduCTED 33. Les données AGPL doivent être transformées au besoin avant l'analyse multivariée sélectionnés pour répondre aux hypothèses du test statistique et la question de recherche abordée, par exemple, une transformation Hellinger est souvent utilisé pour relativiser les données. La figure 3 montre les résultats d'un non -metric échelle multidimensionnelle (SNDM) coordination des mêmes données qui ont été utilisées dans la figure 2; SNDM est un non-paramétrique technique multidimensionnelle qui produit le positionnement 2 ou 3 dimensions de points de données sur la base de la similitude des scores de classement entre les échantillons. Figure 1. Représentant GC-FID chromatogramme. Un échantillon obtenu à partir d' un sol chernozémique brun cultivé a été utilisé pour cette analyse. Les temps de rétention et AGPL correspondants (entre parenthèses) et leur zone de pic (pA) unre indiqué sur la figure pour les pics représentatifs. Pour plus de clarté, tous les sommets sont indiqués sur la figure, bien que cet échantillon particulier a abouti à 33 AGPL identifiés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2. L' abondance relative de six classes différentes de AGPL (% du total des AGPL), et de la biomasse PLFA totale (nmol g -1 de sol sec). Les échantillons de sols luvisoliques boisées ont été utilisées pour cette analyse. Les résultats indiquent une plus grande AGPL totales pour le sol au site 1, qui se trouve sous les arbres plus âgés (> 50 ans), suivi par les intermédiaires d'âge (25 ans) des arbres (Site 2), et enfin les plus jeunes (10 ans) des arbres ( site 3). Relativement AGPL plus saturés sont présents à la plus jeunesite, tandis que d'autres AGPL insaturés sont présents sur le site le plus ancien. Les barres d'erreur représentent les écarts types. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3. mise à l' échelle multidimensionnelle non métrique (SNDM) coordination des AGPL ( en utilisant% du total des AGPL données) pour les axes 2 et 3 d'une solution à 3 dimensions. Cette coordination a été calculée en utilisant les mêmes données que celles utilisées pour la figure 2. La plus jeune site (site 3) sépare très clairement les deux sites plus anciens (Sites 2 et 3), qui montrent un chevauchement dans leur composition de la communauté microbienne PLFA. Le montant de la variation dans les données de la communauté PLFA expliquée par chaque axe est inclus entre parenthèses; 72,5% de la variation est expliquée par ces deux axes pour un 3 dimensolution sionnel SNDM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Pour réduire au minimum et éviter toute interprétation erronée des données AGPL, le dépistage des données attention doit être fait parce que certains AGPL qui se trouvent dans la communauté microbienne du sol sont également présents dans les organismes eucaryotes simples et multicellulaires, tels que les racines des plantes, les algues et les animaux du sol. En outre, les Archaea ne contiennent pas AGPL; à la place, les membranes archées sont composées de lipides éther phospholipides (de PLELs). Par conséquent, le protocole PLFA ne peut pas être utilisée pour caractériser les communautés Archaea dans le sol.

Associant AGPL individuelles à des groupes microbiens spécifiques doivent être prises avec prudence (voir la publication 2011 par Frostegård et ses collègues 34 pour une excellente discussion sur certaines des limites de la méthode PLFA). Au lieu de cela, il peut être plus approprié, comme cela a été fait dans la figure 2, à AGPL de groupe en fonction de leur structure chimique, par exemple, i) AGPL saturés à chaîne droite, ii) AGPL saturés de mi-chain (10-méthyl) de ramification, des acides gras saturés iii) terminale ramifiée, iv) les AGPL mono-insaturés, v) AGPL poly-insaturés, et vi) des acides gras hydroxylés.

Poids de l'échantillon peut avoir besoin d'être ajustée en fonction de la quantité de AGPL extractibles contenus dans un échantillon de sol donné. En n'ajustant la quantité de terre extraite dans les sols actifs moins de microbes, les utilisateurs risquent de ne pas obtenir un nombre suffisant de réponses AGPL (pics) pour représenter avec précision la communauté microbienne globale. Dans les sols très microbiologiquement actifs avec des concentrations élevées de AGPL, les utilisateurs sont à risque de surcharger la colonne de GC, ce qui empêche une quantification précise des AGPL. Dans les deux cas, des échantillons de sol doivent être ré-analysés pour AGPL. Un bon point de départ est d'ajouter 0,5 g pour les échantillons de sol organiques (tels que les sols forestiers), et environ 3 g pour les échantillons de sol minéral. Etant donné que la quantité d'extractibles AGPL est généralement corrélée à la quantité de carbone organique contenu dans le sol d'un échantillon nousight peut être ajustée en fonction de la teneur du sol en carbone, par exemple, 1 g de l' échantillon de sol minéral peut être suffisante pour obtenir une bonne quantification PLFA lorsque la teneur en carbone est de 10-15%, tandis que> 5 g peut être nécessaire si la teneur en carbone est ≤ 0,5 %. Il est toujours une bonne idée de faire un essai avec quelques échantillons pour optimiser le poids échantillon avant l'ensemble est exécuté.

stratégies de dépannage communes pour le protocole PLFA et l'analyse GC sont les suivantes. Si la valeur de référence GC chromatogramme est trop élevée, la bouteille de gaz H 2 doit être changé. Si les pics de solvant ou ISTD sont manquants dans le chromatogramme, il pourrait y avoir un problème avec l' injection de l' échantillon (par exemple, une seringue, de problème avec échantillonneur automatique, flacon vide ou manquante, erreur de positionnement du flacon bouché). Si plus de trois pics sont détectés dans la méthode / échantillon à blanc, il y a contamination de l'ébauche, et il y a une forte probabilité que le même contaminant (s) sera présent dans l'échantillon GC chromatograms. Trouver la source de contamination (médias habituellement aqueuse), ou à tout le moins, faire en sorte que les pics correspondant au contaminant sont retirés des chromatogrammes des échantillons et que ces pics ne sont pas inclus dans l'analyse statistique des données AGPL. En outre, il est une bonne idée d'exécuter hexane rinçages entre les échantillons lorsque report est suspectée. Pics supplémentaires dans le rinçage à l'hexane indiquera report (c. -à- composants plus lourds éluant de l' exécution précédente).

Lipids sont particulièrement sensibles à l'oxydation, et un soin particulier doit être exercé tout au long du protocole pour protéger les échantillons de l'air et de la lumière d'exposition, comme les stocker dans l'obscurité et les garder sous azote. Tous les échantillons et les blancs doivent avoir C19 suffisante: 0 norme de substitution. A C19 manquant: 0 pic, soit dans des échantillons ou des flans, indique une mauvaise récupération ou une perte complète d'analytes. Une réponse de C19: 0 dans les échantillons qui est sensiblement inférieur au mflans éthode / l'échantillon indique une perte d'analytes à un moment donné dans la méthodologie PLFA. Lorsqu'ils sont confrontés à une mauvaise C19: 0 récupération, tous les aspects de la procédure doivent être soigneusement examinées et examinés, y compris l'extraction initiale, toutes les étapes de transfert d'échantillons, l'extraction SPE, la méthylation de l'acide gras, le séchage, le stockage et la manipulation échantillon afin d'isoler le ou les étapes où analytes sont perdus. D'autre part, il se peut que l'extraction de certains échantillons de sol peut donner C19: 0, auquel cas la récupération de la norme de substitution peut être surestimée. Tout en utilisant deux normes ((PC (19: 0/19: 0) et MeC10: 0) ne sont pas une exigence absolue, nous avons trouvé cela très utile lorsqu'il est nécessaire de résoudre Tant que le MeC10:. 0 réponse est adéquate , le dépannage peut se concentrer sur les étapes préalables à l'analyse de GC.

Comme indiqué précédemment, la prudence doit être utilisé lors de l'interprétation des relations de signification et de l'écosystème écologique basée uniquement sur les biomarqueurs dériventd à partir des données AGPL, parce que les études de culture pure révèlent que les souches bactériennes isolées contiennent différentes catégories de AGPL. Au lieu de cela, AGPL de biomarqueurs devraient être considérées comme un complément utile dans une suite d'éléments de preuve en faisant des inférences écologiques plus larges. Dans la littérature, AGPL individuels ont été proposés et utilisés comme marqueurs pour différents groupes microbiens. AGPL saturés sont généralement utilisés pour représenter des bactéries Gram-positives et mono-insaturés AGPL sont utilisés pour les bactéries Gram-négatives. biomarqueurs reconnus pour les bactéries gram-négatives comprennent les acides gras mono-insaturés avec l'insaturation au ω5 ou la position ω7, tels que C16: 1ω7, C18: 1ω7 et C18: 1ω5. En outre, les acides gras cyclopropyle peuvent également être représentatives de bactéries Gram-négatives 35. Par conséquent, AGPL de bactéries gram-négatives peuvent être calculées comme étant égale à la somme de A: 1ω5 + A: 1ω7 + A: 0cyclo. biomarqueurs reconnus pour les bactéries gram-positives sont en phase terminale ramifiées saacides gras turated, iso-ramifié tel que C15: 0i, C16: 0i, C17: 0i; ou antéiso-ramifiés, tels que C15 et C17 0a: 0a. Saturés AGPL avec milieu de chaîne (10-méthyl) ramification, comme 10Me16: 0 et 10Me18: 0 sont typiquement présents dans les actinomycètes 36. Ainsi, AGPL à partir de bactéries Gram-positives peuvent être calculées comme étant égale à la somme de A 0 (ISO, Anteiso, 10-méthyle).

De nombreux biomarqueurs associés à des champignons PLFA sont souvent polyinsaturés, mais certains biomarqueurs fongiques sont monoinsaturés. Par exemple, en termes de biomarqueurs monoinsaturés fongiques, C16: 1ω5 a été identifié comme un indicateur des champignons mycorhiziens arbusculaires (AMF) 37, C18: 1ω9 est commun dans les champignons saprophytes et ectomycorhizes contiennent généralement C16: 1ω9. La présence de di-insaturés en C18: 2ω6,9 se produit souvent en conjonction avec C18: 1ω9 et corrèle également bien avec l'ergostérol fongique stérol, ce qui indique que C18: 2ω6,9 peut représenter de façon adéquate ectomycorrhizae et champignons saprophytes 38. Le tri-insaturé C18: 3ω 6,9,12 a également été utilisé comme un biomarqueur pour les champignons 10; cependant, C18: 3ω6c peut être trouvée dans d'autres organismes eucaryotes, y compris les plantes et les algues, bien qu'il soit généralement pas trouvé dans les bactéries. En terme de protistes du sol, C20: 4ω6c a été reconnu comme un biomarqueur de protistes 39, bien que, d' autres travaux a échoué à détecter C20: 4ω6c même lorsque les populations de protistes viables ont été confirmées visuellement en utilisant la microscopie optique 40.

De nombreuses études portent sur des questions écologiques liées à la communauté globale microbienne du sol en utilisant des techniques d'ordination multivariées comme un outil d'analyse de données PLFA. Lors de l' utilisation de cette approche, certains auteurs ont choisi d'exclure AGPL rares de l'ensemble de données en supprimant les AGPL qui sont présentes dans moins de 5% des échantillons 4. Les acides gras saturés normaux C16: 0 et C18: 0 sont abondants dans tous les micro-organismes du sol, y compris les procaryotes et les EUKaryotes. Par conséquent, certains chercheurs choisissent de supprimer ces AGPL avant l'analyse statistique sur la base qu'ils peuvent ne pas être des indicateurs sensibles de la composition de la communauté microbienne du sol – bien que C16: 0 et C18: 0 sont encore à être inclus lorsque additionnant tous les AGPL pour un indice de la biomasse microbienne. En terme d'analyses statistiques, de nombreux chercheurs choisissent de mener une analyse multidimensionnelle (SNDM) coordination non-métrique car cette technique est bien adaptée aux données qui peuvent ne pas être normalement distribué 33. Des analyses supplémentaires liées à des variables catégoriques peuvent inclure l'analyse des espèces indicatrices, qui peuvent se rapporter l'occurrence de AGPL spécifiques aux groupes catégoriques et les procédures de réponse de permutation multiples (PPRM), qui peut aider à déterminer les similitudes ou les différences entre les communautés microbiennes assignées à des groupes catégoriques. En outre, les arbres de régression multivariée (MRT) peuvent être particulièrement utiles lorsque l'influence de plusieurs variables expérimentales oules traitements doivent être évalués en tant que variables explicatives potentielles de 5 (par exemple, la texture du sol, l' humidité, l' âge de la remise en état).

Une fois établi, le protocole PLFA est une méthode d'analyse relativement simple qui peut être très utile lors de la quantification réponse microbienne du sol aux changements environnementaux et les perturbations anthropiques. Bien que les techniques moléculaires telles que les empreintes génétiques sont mieux adaptés à la caractérisation détaillée des communautés microbiennes, la méthode PLFA présente l'avantage de fournir des informations quantitatives sur la biomasse microbienne totale 34. Dans notre laboratoire de recherche, une personne peut confortablement traiter un ensemble de 20 échantillons de plus de 4 jours, et nous avons trouvé le protocole présenté ici pour être une technique robuste et reproductible pour évaluer la qualité biologique du sol.

La puissance de la méthode PLFA peut être considérablement étendu en le couplant à analyse des isotopes stables 41, 42. Plus précisément, outre of 13 substrats C marqué sur les sols permet la quantification de substrat incorporation dans les microorganismes du sol si l' analyse isotopique des AGPL individuels 41. En outre, cette méthode semble être un outil très prometteur pour élucider les liens trophiques dans les aliments du sol 42 toiles.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was financed in part by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada. The authors acknowledge Jela Burkus, Donna Macey, and Jennifer Lloyd for their technical expertise and their contribution to the optimization of this method.

Materials

Pierce Reacti-Vap III-evaporator gassing manifold with 27 ports Used in Steps 1-3
Compressed Nitrogen Praxair Ni-T Dangerous: Use only after training and minimize contact and use; Used in Steps 1-3
Disposable centrifuge tube and Teflon-lined cap Fisher Scientific 05-569-3 Used for Step 1 (1 per sample) and Step 2 (1 per sample)
Disposable glass long-necked Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20D Used for Step 1 (2 per sample)
Disposable glass short-necked Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-4 Used for Step 2 (1 per sample), Step 3 (1 per sample), GC analysis (1 per sample),, and one for each type of solution dispensed during PLFA methods (~10 per batch of samples)
Elastic band Grand & Toy 42199 1 per sample for freeze drying
Freeze Dryer-Labconco 7806002 and 7753000 Used for preparing samples for PLFA analysis – use whatever model your lab has
Freezer (-20 °C, -80 °C) Revco ULT2586-5-A36 Minus 80 °C is used for freezing freshly collected soil samples, -20 °C is used for storing samples at end of each of 3 steps of PLFA analysis
Gas chromatograph – Agilent 6890 Series capillary gas chromatograph (GC;, Wilmington, DE) equipped with a 50 m Ultra 2 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane column Agilent Technologies Used for GC analysis, other models of GC could also be used (1 needed)
Analytical column Agilent Technologies 19091B-105
Gas chromatograph insert Agilent Technologies 5183-4692 Used for GC analysis (1 per sample)
Gas chromatograph vial and lid Agilent Technologies 5188-6592 Used for GC analysis (1 per sample)
Hexanes Fisher Scientific H292-4 Hazardous: use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3)
Hot water bath -Isotemp 220 Fisher Scientific Used for Step 3 (1 per batch of samples)
Kimwipe Fisher Scientific 06-666-2 Used for freeze drying samples
KOH,  ACS grade Fisher Scientific P250-500 Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Used for making citrate buffer (used in Step 1) and methanolic KOH (step 3)
Lab quake end-over-end shaker for centrifuge tubes Barnstead/Thermolyne 3,625,485 Used for Step 1 (1 per batch of samples of appropriate holding capacity)
MeC10:0 methyl decanoate internal standard Sigma-Aldrich 299030-2.5G Used for GC analysis
Methanol Fisher Scientific A454-4 Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (step 1) + 5 ml (step 2) + 0.5 ml (step 3))
MIDI Peak Identification Software MIDI, Inc., Newark, DE Used for interpreting GC analysis output
MIDI Calibration Standard Mix for Microbial Identification System Lab Sphere Inc 1200-A Used as a Calibration mix for TSBA 40
Nitrile gloves Fisher Scientific 27-058-52 Used always when conducting PLFA lab work
pH Meter – Accumet XL200 Fisher Scientific Used for making citrate buffer
Pipette (0.2 – 2 ml)- Socorex -Calibra Digital 832 Macropipette Socorex 832.02 Used throughout Steps (1 per sample)
250 µL gastight syringe Hamilton  1725 Used for GC analysis (1 per sample)
silver shield gloves Sigma-Aldrich Z529575 For use when handling chloroform
solid phase extraction (SPE) column Agilent Technologies 5982-2265 Used for Step 2 (1 per sample)
SPE glass column holder with spigots  and vacuum apparatus attached Sigma-Aldrich Used for Step 2 (1 per batch of samples)
Vortex – Barnstead International Maxi Mix II- M37615 Barnstead International  M37615 Used in Steps 1-3
Water -  ultra-pure and Chromosolv HPLC grade Sigma-Aldrich 270733-4L Used throughout analysis
Whirl-Pak® bags Fisher Scientific 01-812-120 Used in sample collection – 2 bags required per sample collected
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Quideau, S. A., McIntosh, A. C., Norris, C. E., Lloret, E., Swallow, M. J., Hannam, K. Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils. J. Vis. Exp. (114), e54360, doi:10.3791/54360 (2016).
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