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Environment

Estrazione e l'analisi delle microbica fosfolipidi acidi grassi nei terreni

Published: August 26, 2016
doi:
10.3791/54360
, , , , ,
1Department of Renewable Resources,University of Alberta, 2Department of Science, Augustana Faculty,University of Alberta, 3Laboratoire Génie Civil et géo-Environnement,Université de Lille, 4Department of Earth and Environmental Sciences,Mount Royal University, 5Forest Ecology & Production, Great Lakes Forestry Centre,Natural Resources Canada

Summary

Gli acidi grassi dei fosfolipidi forniscono informazioni sulla struttura delle comunità microbiche del suolo. Vi presentiamo i metodi per l'estrazione di campioni di terreno con una miscela monofase cloroformio, frazionamento dei lipidi estratti utilizzando colonne di estrazione in fase solida, e metanolisi per la produzione di esteri metilici degli acidi grassi, che vengono analizzati mediante gascromatografia capillare.

Abstract

Gli acidi grassi fosfolipidi (PLFAs) sono componenti chiave delle membrane cellulari microbiche. L'analisi dei PLFAs estratto da terreni in grado di fornire informazioni sulla struttura complessiva delle comunità microbiche terrestri. PLFA profiling è stato ampiamente utilizzato in una vasta gamma di ecosistemi come un indice biologico della qualità complessiva del suolo, e come indicatore quantitativo di risposta del terreno alla gestione del territorio e altri fattori di stress ambientali.

Il metodo standard qui presentata delinea quattro fasi fondamentali: 1. l'estrazione del grasso da campioni di terreno con una miscela di cloroformio monofase, 2. frazionamento con colonne di estrazione in fase solida per isolare fosfolipidi di altri lipidi estratti, 3. metanolisi di fosfolipidi per la produzione di acidi grassi esteri metilici (fames), e 4. analisi FAME mediante gascromatografia capillare utilizzando un rilevatore a ionizzazione di fiamma (GC-FID). Due standard sono utilizzati, tra cui 1,2-dinonadecanoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (PC (19:0/19: 0)) per valutare il recupero complessivo del metodo di estrazione, e metil decanoato (MeC10: 0) come standard interno (ISTD) per l'analisi GC.

Introduction

Gli acidi grassi fosfolipidi (PLFAs) fanno parte delle membrane cellulari microbiche dai domini Batteri e eucarioti. I microrganismi producono PLFAs di diverse lunghezze di catena e la composizione come un mezzo per mantenere l'integrità della membrana cellulare e funzione cellulare in risposta alle loro condizioni ambientali immediati; di conseguenza si può affermare che le comunità microbiche che sono separati geograficamente ma sono sottoposte alle condizioni del terreno simili esprimeranno PLFAs simili. PLFAs terreno con una lunghezza di catena da 14 a 20 atomi di C sono generalmente considerati di origine prevalentemente batterica e fungina 1. In colture miste, analisi PLFA non può essere utilizzato per identificare singole specie microbiche, ma può fornire un'impronta complessiva delle comunità microbiche presenti nel suolo. Inoltre, dal momento che PLFAs sono rapidamente degradati dopo la morte delle cellule, possono essere considerati rappresentativi della comunità microbica del suolo valida 2. questa technique è stato ampiamente utilizzato per caratterizzare la composizione strutturale delle comunità microbiche trovate in una vasta gamma di ambienti, che vanno dalle foreste 3-4 a 5-6 praterie e campi agricoli 7. E 'stato applicato con successo in caratterizzare la risposta del terreno a terra cambiamenti di gestione, tra cui foresta disboscamento 8, 9 calcinazione, bonifiche 10-12, così come disturbi quali incendi 13, la contaminazione da metalli e idrocarburi 14 15, e insetti scoppio 16 .

Il metodo analitico PLFA contemporanea si è evoluta nel corso degli ultimi sei decenni attraverso diverse innovazioni chiave da parte di un certo numero di gruppi di ricerca. Nel 1958, un miglioramento significativo nasce dalla regolazione cloroformio: metanolo: rapporto acqua nella soluzione di estrazione per spostare la miscela da una monofasica ad un sistema bifasico 17. Questa estrazione del grasso ottimizzato e l'isolamento pro rivistoProtocollo divenne noto come il metodo Bligh e Dyer. Il protocollo è stato adottato da molti laboratori nel corso dei prossimi decenni e, in questo periodo, Bianco e colleghi hanno contribuito progressi significativi per il metodo; per esempio, hanno migliorato la fase di estrazione scambiando un tampone fosfato per l'acqua, e sono ottimizzati l'analisi mediante gascromatografia (GC) attraverso una maggiore identificazione dei picchi e quantificazione. Forse di più rilevanza per la scienza del suolo, hanno determinato nel 1979 che i lipidi estratti potrebbero essere utilizzati come un indice di struttura microbica quando hanno esaminato la biomassa microbica dei sedimenti marini 18.

Ulteriori sviluppi si sono verificati nel 1980 come il metodo è diventato più ampiamente utilizzato nella scienza del suolo, in particolare in relazione alla rizosfera 19. A quel tempo, il metodo incluso nonadecanoate metil (MeC19: 0) come standard interno 19 e l'uso di una colonna di acido silicico per lipidi frazionamento 21 </ Sup>. In seguito il suo lavoro con Bianco 19,21, Tunlid tornato in Svezia e ha iniziato la ricerca in collaborazione con Bååth e Frostegård. Esaminando l'efficienza di diversi tamponi di estrazione per una serie di suoli variano in contenuto di sostanza organica, il gruppo ha mostrato che il tampone citrato aumentato la quantità di lipidi fosfato estratta rispetto al tampone fosfato 22. Inoltre, la loro pubblicazione 1993 23 sull'influenza di calcinazione sulle comunità microbiche del suolo ha continuato a diventare un classico di citazione nel suolo Biologia e Biochimica 24. I ricercatori hanno utilizzato l'analisi delle componenti principali nella loro elaborazione dei dati. analisi PLFA, come il metodo è ora chiamato, genera grandi insiemi di dati e l'utilizzo di procedure di statistica multivariata per elaborare questi dati era altamente innovativo per il tempo e di ispirazione per molti. In concomitanza al il lavoro svolto in Svezia, modifiche alla procedura PLFA sono stati oggetto di indagine inGermania da parte Zelles e colleghi 25-26. La loro versione della procedura era notevole per l'uso di una colonna di estrazione in fase solida (SPE) invece della colonna acido silicico ma, nel complesso, era più intensa di laboratorio.

Carta di Frostegård 23, insieme con la metodologia dettagliata di White & Ringelberg 27, ha fornito le basi per una esplosione nell'utilizzo della tecnica PLFA per indagare questioni fondamentali nella scienza del suolo. Da allora, ulteriori perfezionamenti del metodo da Firestone e colleghi hanno incluso l'aggiunta di uno standard GC interna (C10: 0) e C19: 0 come standard surrogato per migliorare la quantificazione 28, e sostituendo l'uso di separatore imbuti per fiale fondo rotondo per semplificare estrazione 29. Più recentemente, Chowdhury e Dick 30 studiato il passo metilazione e ha riferito che delle due procedure metilazione usati nella scienza del suolo letteratura metodo KOH / MeOH identified una gamma più ampia di acidi grassi.

Il metodo proposto si basa principalmente sul metodo originale sviluppato da Bligh e Dyer, e incorpora le modifiche di cui sopra, come l'uso di metanolica KOH per la fase di metilazione. Due norme sono utilizzate per ogni campione: norma surrogato della 1,2-dinonadecanoyl- sn -glycero-3-fosfocolina (PC (19: 0/19: 0)), che viene aggiunta al campione di terreno prima della prima estrazione per valutare l'efficienza e recupero del intero protocollo e uno standard strumento di decanoato metil (MeC10: 0), che viene aggiunto prima dell'identificazione e quantificazione mediante GC.

Riconosciamo che il metodo PLFA è comunemente utilizzato da molti laboratori ecologia microbica in tutto il mondo, ed è stato documentato molte volte, anche da parte della International Organization for Standardization 2. L'obiettivo di questo lavoro è quello di presentare un facile da seguire e robusto protocollo che può essere utile per il suologli scienziati che stanno cercando di imparare la tecnica PLFA.

Protocol

NOTA: assicurarsi sempre che un equipaggiamento di protezione individuale (DPI) è consumato in tutto il protocollo. Vetreria non deve essere toccata con le mani nude. Lipidi dalle dita, capelli, grassi, oli e idrocarburi sono tutti potenziali contaminanti. Indossare sempre guanti di nitrile e guanti di risciacquo con il 70% di alcol durante la manipolazione di oggetti di vetro pulito. 1. preparazione dei recipienti per l'analisi Vetreria usa e getta (ad esempio, provette da centrifuga) Avvolgere in un foglio di alluminio e calore in forno a muffola per quattro ore e mezza a 450 ° C. Politetrafluoroetilene (PTFE) -lined tappi Mettere a bagno tappi per un'ora in un detergente fosfato, e poi lavare con spazzola in acqua calda e detersivo fosfati. Risciacquare il sapone con acqua di rubinetto. Mettere in bagno acido (5% HCl) per un'ora soltanto (non lasciare più come le navi possono cadere fuori i tappi se sono impregnati per troppo tempo. Risciacquare tre voltein acqua di rubinetto. Risciacquare tre volte in acqua distillata. Asciugare in forno a 40 ° C. Vetreria riutilizzabile (ad esempio, 10 ml, 15 ml, 45 ml flaconi / vasi) Lavare con spazzola in acqua calda e detersivo fosfati. Risciacquare sapone con acqua di rubinetto e posto in bagno acido (5% HCl) durante la notte. Risciacquare tre volte in acqua di rubinetto, quindi risciacquare tre volte in acqua distillata e poi asciugare in forno a 40 ° C. Avvolgere in un foglio di alluminio pulito (50 ml vasetti sono confezionati singolarmente e altri oggetti di vetro è avvolto in lotti di campioni, ad esempio, 20) e di calore in forno a muffola per quattro ore e mezza a 450 ° C. Vetreria volumetrica (ad esempio, pallone volumetrico) Lavare con spazzola in acqua calda e detersivo fosfati. Risciacquare sapone con acqua di rubinetto e posto in bagno acido (5% HCl) durante la notte. Risciacquare tre volte in acqua di rubinetto, sciacquare tre volte in acqua distillata, e poi asciugare in stufa a 40 &# 186; C. Prima dell'uso lavare 3 volte con una piccola quantità di solvente (ad esempio, metanolo) – non mettere vetreria volumetrica nel forno a muffola. 2. Raccolta ed elaborazione dei campioni di terreno prima dell'analisi PLFA Raccogliere campioni di terreno in sacchetti sterili, e se questi possono essere analizzati immediatamente, congelarli appena possibile. Conservare i campioni in congelatore (-80 ° C) fino al momento di procedere con la liofilizzazione di campioni. Congelare lotti secco di campioni seguendo le istruzioni del liofilizzatore. Trasferire ciascun campione liofilizzato di nuovo marcato sacca sterile. Pesare campione dal materiale liofilizzato in sacchetto in provetta da centrifuga smorzato pre-etichettati per l'estrazione PLFA. NOTA: Una linea guida generale è quello di utilizzare 0,5 g per i materiali organici (carbonio contenuto> 17% WT) e fino a 3,0 g per campioni di terreno minerale. Record peso del campione per ogni campione. Ogni 10 campioni, pesare, inoltre, unduplicato aggiuntivo per l'analisi, e per ogni 20 campioni comprendono uno spazio (cioè, un tubo da centrifuga che non ha alcun campione in essa – usato come controllo di identificare qualsiasi potenziale contaminazione durante il processo di estrazione PLFA). lotti di processo di provette dei campioni allo stesso tempo. NOTA: Un insieme di 20 campioni corrisponderà ad un lotto di 23 provette per campioni (campioni da 1 a 10, uno duplicati di campione 10, campioni da 12 a 22, un duplicato di campione 22, ed uno vuoto = lotto di 23 tubi di campione). NOTA: Condurre estrazione, poi la separazione, poi la metilazione in lotti di campioni prima di preparare per l'analisi GC e tutti in esecuzione insieme. Questo aiuta a identificare dove gli errori si sono verificati se qualcosa va storto, e può contribuire a ridurre il numero di estrazioni necessarie ripetizione. 3. PLFA Tecnica (passaggi sono per singolo campione, ma completa di un intero lotto alla volta) NOTA: Tutte le fasi della tecnica PLFA descritto nei passaggi1-3 di seguito dovrebbero essere condotte in una cappa aspirante con appropriati DPI e seguendo le linee guida di sicurezza di laboratorio. Estrazione (Fase 1): Preparare 5,0 M KOH sciogliendo 14 g di KOH in 50 ml di acqua distillata, acqua deionizzata (dH 2 O). Preparare tampone citrato 0,15 M sciogliendo 31,52 g di acido citrico monoidrato in 400 ml di dH 2 O. Regolare a pH 4,00 ± 0,02 con l'aggiunta di 5,0 M KOH; circa 45-50 ml di 5,0 M KOH saranno tenuti a regolare il pH a 4,00. Quando il pH è regolato, diluire tampone citrato a 1000 ml utilizzando un pallone tarato. Conservare tampone citrato in frigorifero quando non in uso (fino a un mese). Preparare quotidianamente il PC (19: 0/19: 0) norma surrogata nonadecanoate diluendo 250 ml di soluzione madre (10 mg / ml) in 25 ml di cloroformio (ciò fornisce serie surrogata sufficiente per un lotto di 23 campioni). Aggiungere 0,5 ml di PC (19: 0/19: 0) soluzione standard surrogato alla provetta da centrifuga. UNdd estraente Bligh e Dyer al campione di terreno nel seguente ordine: i) 2,0 ml di tampone citrato, ii) 2,5 ml di cloroformio, e iii) 5,0 ml di metanolo. campione Cap con un cappuccio rivestito in PTFE e vortex per 30 sec; mettere in shaker end-over-end per 2 ore. Centrifugare a 226 xg per 15 min con la protezione sopra. Disegnare il surnatante con una pipetta Pasteur e trasferirlo in una fiala di vetro 45 ml etichettati. Aggiungere un secondo giro di Bligh e Dyer estraente per ogni campione, e ripetere i punti 4 e 5 di cui sopra. Disegnare surnatante con una pipetta Pasteur e trasferimento stessa etichetta 45 ml fiala di vetro. Aggiungere al etichettato 45 ml di vetro fiala contenente surnatante: i) 5,0 ml di cloroformio, e ii) buffer di 5.0 ml citrato. Cap con protezione bianca e vortex vetro PTFE-rivestito fiala per 30 sec. Lasciate riposare una notte a temperatura ambiente al buio (per evitare l'ossidazione). aspirare accuratamente la fase acquosa superiore del flacone 45 ml (se non vuoto è disponibile, la pipetta deve essere abbassato attraverso l'aquefase di unità organizzative con molta attenzione per non raccoglie alcuna nella pipetta durante la dispensazione della fase organica). Pipetta inferiore fase organica in etichetta 15 ml fiala. Luogo partita di 15 ml flaconcini sotto N 2 compressa (per evitare l'ossidazione) a temperatura ambiente. Evaporare cloroformio lentamente, fissando la portata N 2 a increspare la superficie del liquido nel flaconcino ma non salire sulle pareti della fiala. Vite su campioni cap e memorizzare rivestiti in PTFE nel congelatore a -20 ° C avvolto in un foglio di alluminio (involucro in lotti piuttosto che singolarmente) fino al momento di procedere con la Fase 2. Lipid frazionamento (Fase 2) Posizionare titolare colonna SPE con rubinetti sulla vasca di vetro. Inserire nuove colonne SPE (silice, 500 mg, 6 ml) in rubinetti. colonne Label necessario (consigliato per evitare di confondere i campioni). Condizionare ogni colonna aggiungendo 5 ml di acetone e permettendogli di scarico attraverso, e quindi aggiungere due aggiunte di 5 ml di cloroformio (volume totale = 10 ml). Lasciare secondo lavaggio cloroformio a defluire fino ~ 1 mm sopra la fritta e quindi chiudere il rubinetto. Ridisciogliere campione (memorizzata in 15 ml flaconcino al termine del passaggio 1) aggiungendo 0,5 ml di cloroformio per fiala e agitare delicatamente. campione alla colonna SPE con una pipetta Pasteur di trasferimento ri-dissolto; ripetere per un totale di 2 trasferimenti (volume di trasferimento totale di 1 ml di cloroformio per campione). Lay campione lipidi direttamente nel centro della colonna e lasciare il solvente per drenare completamente nel serbatoio. Eluire lipidi neutri aggiungendo 5 ml di cloroformio per ogni colonna. Lasciare solvente per drenare completamente nel serbatoio. Eluire glicolipidi aggiungendo 5 ml di acetone per ciascuna colonna. Lasciare solvente svuotare completamente nella vasca di raccolta. Rimuovere la base della colonna dal serbatoio e scarico serbatoio con apparecchiatura a vuoto. Inserire cremagliera di provette pulite ed etichettati nel serbatoio. Sostituire stare colonna serbatoio; colonna denominata di cui sopra dovrebbe allinearsi con centr etichettatubo ifuge sotto. Eluire fosfolipidi in provette da centrifuga, aggiungendo 5 ml di metanolo per ciascuna colonna. Attendere che le colonne SPE ad asciugare in cappa aspirante, prima del loro smaltimento. Dry frazioni fosfolipidi giù a temperatura ambiente in N compressa 2. Tubi di spurgo con N 2. Vite su campioni cap e memorizzare rivestiti in PTFE nel congelatore a -20 ° C avvolti in un foglio di alluminio (involucro in lotti piuttosto che singolarmente) fino al momento di passare alla Fase 3. Lipid metilazione (Fase 3). Accendere il bagno di acqua calda impostato a 37 ° C. Preparare acido acetico 1M (se non già fatto) sciogliendo 57,1 ml di acido acetico glaciale a 1000 ml di dH 2 O utilizzando un pallone tarato 1.000 ml. Questa soluzione può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di tre mesi. . Preparare lotto di KOH in metanolo. Preparare 0,2 M soluzione KOH sciogliendo 0,45 g di KOH in 40 ml di metanolo. Regolare il volume di KOH e metanolo secondo undimensione del lotto nticipated nella Fase 3. Preparare questa soluzione al giorno; non conservare per periodi più lunghi. Rimuovere i campioni (in provette da centrifuga memorizzati dopo il passaggio 2) dal congelatore e permettono campioni di raggiungere temperatura ambiente. Aggiungere 0,5 ml di cloroformio e 0,5 ml di metanolo a ciascun campione, seguiti da 1,0 ml metanolica di KOH. Tappare saldamente le provette con tappo rivestito in PTFE. Agitare per mescolare. I campioni sigillati a 37 ° C bagno per 30 min. Assicurarsi che il livello dell'acqua è un minimo di 1-2 mm di sopra del livello del liquido campione. Rimuovere e permettono campioni raffreddare. Mentre i campioni sono a bagnomaria, etichettare piccole fiale di vetro con gli ID dei campioni (flaconcino di vetro da 10 ml con tappo rivestito in PTFE). Aggiungere 2,0 ml di esano per ogni campione e turbolenza. Quindi aggiungere 0,2 ml di acido acetico 1,0 M per ogni campione e agitare per mescolare di nuovo; separazione di fase dovrebbe diventare visibile. Aggiungere 2,0 ml di dH 2 O per ogni campione di rompere fase. campioni Vortex per 30 sec. campioni centrifugare a 226 xg per 2 minuti. utilizzandobreve pipetta Pasteur, trasferire la fase superiore per pulire etichettato 10 ml. Fare attenzione a non trasferire qualsiasi della fase inferiore (acquosa). Aggiungere 2,0 ml di esano a ciascuna provetta da centrifuga e turbine. campioni Vortex per 30 sec. campioni centrifugare a 226 xg per 2 minuti. Utilizzando breve pipetta Pasteur, ancora una volta aggiungere la fase superiore al flaconcino di vetro da 10 ml etichettati. Evaporare solvente in etichetta-10 ml fiala di vetro a temperatura ambiente sotto N 2. Vite su campioni cap e memorizzare rivestiti in PTFE nel congelatore a -20 ° C avvolto in un foglio di alluminio (involucro in lotti piuttosto che singolarmente) fino al momento di procedere con l'analisi GC. Assicurarsi di etichettare tutti i campioni. Gascromatografo (GC) Analisi NOTA: L'identificazione e la quantificazione dei singoli PLFAs è compiuta utilizzando un GC collegata sia ad un FID o un rivelatore MS. Mentre le istruzioni riportate di seguito sono per GC-FID, la preparazione del campione sarebbe valida per GC-MS come well. Un esempio di set-up per un sistema GC-FID dovrebbe includere un 25 m × 0,2 millimetri × 0,33 micron (5% fenil) colonna -methylpolysiloxane con il seguente protocollo di temperatura: temperatura iniziale 190 ° C, rampa di 10 ° C / min a 285 ° C , tenere 9.5 min, rampa di 60 ° C / min a 310 ° C, tenere 0,42 min 31. Preparare il GC standard interno (ISTD) con l'aggiunta di una goccia di MeC10: 0 (metil decanoato) a 100 ml di esano (record di peso aggiunto a 0,1 mg). Accendere gas per GC e poi accendere il GC. Assicurarsi che H 2, N 2 e cilindri pneumatici sono aperti e che vi sia gas sufficiente a eseguire l'analisi (H 2 non dovrebbe mai scendere sotto 500 psi). Verificare che le condizioni di una buona taratura incontra eseguendo standard di calibrazione contenenti una miscela di acidi grassi, seguito da uno spazio esano. Identità di acidi grassi singoli possono essere assegnati manualmente basata su confronti con tempi di ritenzione ottenuti per gli standard, e questo può essere automatically assegnato utilizzando software 31 disponibili in commercio. In tutti i casi, l'identificazione univoca può essere ottenuto utilizzando un rivelatore MS 2. NOTA: ulteriori segnali di una buona taratura comprendono una linea di base piatta e nessuna contaminazione nel risciacquo esano. Sciogliere ciascun campione residuo PLFA (contenuta in flaconcino di vetro da 10 ml da lipidi metilazione punto 3) in 150 microlitri della soluzione ISTD e trasferire in fiala GC (alternativa utilizzare da 50 a 75 microlitri se la risposta del campione è previsto per essere debole, come nel molto terreni sabbiosi). Impostare il volume di iniezione del campione a 2 ml. Impostare la temperatura del FID a 300 ° C. Eseguire i campioni utilizzando una temperatura di ingresso di 250 ° C, con H 2 come gas di trasporto (portata 1,3 ml / min) ed un rapporto di divisione di 30: 1.

Representative Results

Gli acidi grassi vengono indicati come X: YωZ, dove X rappresenta il numero di atomi di carbonio, Y rappresenta il numero di doppi legami, e Z indica la posizione del primo doppio legame dall'estremità alifatici (ω) della molecola. I suffissi 'c' e 't' indicano isomeri cis e trans geometrici. Il prefissi e suffissi 'a' e 'i' si riferiscono a anteiso e iso ramificazione e Io e OH specificare i gruppi metilici e gruppi idrossile, rispettivamente. run Post-GC, controllare che i campioni hanno ricevuto adeguata ISTD, cercando al 10: 0 di picco. Controllare anche la risposta degli standard GC, vale a dire, le fiale contenenti esano con una soluzione ISTD aggiunto; questi dovrebbero avere altri picchi. risposta standard interno dovrebbe essere simile in tutte le piste. La figura 1 presenta una rapprecorsa del campione tiva. La grande esano picco di solvente appare tipicamente in un tempo di ritenzione (RT) circa 1,8 min. Il picco dello standard ISTD (C10: 0) appare in una RT di 3,4 min, mentre la C19: 0 ha una RT di 16,2 min. L'analisi GC separa le PLFAs base alla loro lunghezza della catena, con catene più lunghe eluendo più lentamente; per esempio, C18: 0 eluisce a 14,4 min, mentre C16: 0 eluisce a 10.8 min. Inoltre, questo protocollo analitico può separare PLFAs base al loro grado di insaturazione e la posizione del loro doppio legame; per esempio, C18: 0 eluisce a 14,4 min, mentre C18: 1 9c e C18: 1 7c eluire al 14,0 e 14,1 minuti, rispettivamente (Figura 1). Infine, PLFAs di simile lunghezza della catena e la saturazione, ma la configurazione ramificazione diversa (anteiso contro ISO) possono essere separati; per esempio, C15: 0i e C15: 0a eluire a 8.6 e 8.7 min, rispettivamente (Figura 1). Le aree dei diversi picchi GC possono essere importato in un foglio di calcolo per elaborare ulteriormente le informazioni cromatogramma gas. Ogni PLFA identificato è quantificato (nmol g -1 di suolo secco) mediante la seguente equazione: dove F è un coefficiente di correzione che tiene conto FID selettività e le differenze molarità tra acidi grassi 32, areaPLFA è l'area di picco per ciascuna identificata PLFA, areaC10: 0 è l'area di picco per l'ISTD (MeC10: 0), C10: 0 std aggiunto è la quantità di ISTD (nmol) aggiunto a ciascun campione prima corsa GC, il rapporto (C19: 0 std aggiunto / C19: 0 di esempio) corrisponde al recupero del PC (C19: 0 / C19: O) serie surrogata, e il peso del campione è la quantità di forno essiccati suolo (g) aggiunto alla provetta campione centrifuga originale e utilizzato per estrarre PLFAs. NOTA: Le aree sotto la differepicchi nt sono espressi come aree di picco, risposta o risposta% a seconda del sistema GC. All'interno della gamma relativo al terreno PLFA caratterizzazione, aree possono essere considerate linearmente proporzionale al peso degli acidi grassi; in alternativa, piccoli fattori di correzione possono essere applicati per spiegare FID selettività 32. Inoltre, poiché i risultati sono inizialmente, espresse in percentuale in peso, devono essere normalizzati per produrre quantità molari. Regolazione per differenze molarità viene ottenuto tenendo conto pesi molecolari dei singoli acidi grassi; tabelle pubblicate 32 e 31 software commerciale sono a disposizione per aiutare quando normalizzare per molarità anche. La quantità di ISTD (nmol) aggiunto ad ogni campione può essere ulteriormente calcolato come: C10: 0std aggiunto = [ISTD] × V (STD aggiunto) <p class="jove_content" fo:keep-together.wntro-page = "1"> dove [ISTD] è la concentrazione (nmol l -1) del MeC10: 0 (metil decanoato) disciolto in esano (vedi punto 3.4.1), e V (STD aggiunto) è il volume (L) di soluzione preparata ISTD aggiunto a ciascun campione prima corsa GC (cioè, 150 microlitri secondo il passaggio 3.4.4). La quantità di C19: 0 (nmol) presente in ciascun campione durante l'analisi GC corrisponde a: dove areaC19: 0 è l'area di picco per C19: O, mentre la corrispondente quantità di C19: 0 (nmol) aggiunto a ciascun campione all'inizio del metodo di estrazione PLFA (cfr Fase 3.1.3) è: dove [19: 0] Std (mg L -1 </sup>) è la concentrazione di C19: 0 nonadecanoate serie surrogata disciolto in cloroformio (passaggio 3.1.3), V (19: 0 std aggiunto) è il volume del campione preparato surrogata aggiunto ad ogni campione all'inizio dell'estrazione PLFA metodo (cfr Fase 3.1.3), M 19: 0 è il peso molecolare di 1,2-dinonadecanoyl- sn -glycero-3-fosfocolina (PC (19: 0/19: 0)). NOTA: Una mole di C19: 0 nonadecanoate rendimenti standard di surrogati due moli di C19: 0 in seguito alla fase di metilazione, mentre il C10: è aggiunto 0 standard dopo metilazione. I seguenti PLFAs sono in genere esclusi dall'analisi delle comunità microbiche del suolo: i) PLFAs che sono <14 C e> 20 C di lunghezza, e ii) PLFAs con meno dello 0,5% del totale nella zona di picco. Una volta che questi PLFAs sono state escluse, le risposte da tutti i restanti PLFAs possono essere sommati per ottenere il bi totale PLFAomass (nmol g -1 di terreno asciutto). L'analisi univariata dei dati PLFA (ad esempio, ANOVA, a seguito di trasformazione dei dati a seconda dei casi per soddisfare le ipotesi in corso di esecuzione del test) può essere utilizzato per confrontare totale della biomassa PLFA e / o PLFA biomassa dei gruppi selezionati tra i gruppi di campioni / trattamenti. Per esempio, la Figura 2 illustra i risultati per la relativa distribuzione di diversi gruppi PLFA, come PLFAs saturi a catena lineare, PLFAs saturi sia con metà catena (10-metil) o ramificazione terminale, e mono- o PLFAs polinsaturi, nonché la somma di PLFAs totali (nmol g -1 di suolo secco). In questo particolare esempio, l'età degli alberi (che diminuisce da Sito 1 al sito 3) si vede che influenzare sia PLFAs totali e la relativa distribuzione dei diversi gruppi PLFA. Per valutare modelli generali di composizione PLFA tra campioni, analisi multivariata di tutti PLFAs può essere conduCTED 33. I dati PLFA devono essere trasformati secondo necessità prima analisi multivariata selezionato per soddisfare le ipotesi del test statistico e la domanda di ricerca viene affrontato, ad esempio, una trasformazione Hellinger è spesso usato per relativizzare i dati. Figura 3 mostra i risultati da un non -metric scaling multidimensionale (NMDS) l'ordinazione dei dati stessi che sono stati utilizzati in figura 2; NMDS è un non-parametrica, tecnica multivariata che produce il posizionamento a 2 o 3 dimensioni di punti dati basato sulla somiglianza di classifica punteggi tra i campioni. Figura 1. Rappresentante GC-FID cromatogramma. Un campione ottenuto da un terreno Brown Chernozemic coltivata è stato usato per questa analisi. I tempi di ritenzione e PLFAs corrispondenti (tra parentesi) e la loro area di picco (Pa) unri indicato sulla figura per i picchi rappresentativi. Per chiarezza, non tutti i picchi sono indicati sulla figura, anche se questo particolare campione ha prodotto 33 PLFAs identificati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2. relativa abbondanza di sei diverse classi di PLFAs (% del PLFAs totali), e biomassa totale PLFA (nmol g -1 di terreno asciutto). I campioni da foreste terreni Luvisolic sono stati utilizzati per questa analisi. I risultati indicano una maggiore PLFAs totali per il suolo a Sito 1, che si trova sotto gli alberi più grandi (> 50 anni), seguiti dalle intermedie età (25 anni) Alberi (sito 2), e infine i più giovani (10 anni) alberi ( sito 3). Relativamente PLFAs più saturi sono presenti al più giovanesito, mentre altri PLFAs insaturi sono presenti presso il sito più antico. Barre di errore rappresentano deviazioni standard. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3. Non-metrica scaling multidimensionale (NMDS) ordinazione di PLFAs (utilizzando% del totale PLFAs dati) per gli assi 2 e 3 di una soluzione a 3 dimensioni. Questa ordinazione è stato calcolato utilizzando gli stessi dati come quelli utilizzati per la Figura 2. La più giovane sito (site 3) separa in modo molto chiaro dai più grandi due siti (siti 2 e 3), che mostrano sovrapposizione nella loro composizione comunità microbica PLFA. La quantità di variazione nei dati comunità PLFA spiegata da ciascun asse è incluso tra parentesi; 72,5% della variazione è spiegata da questi due assi per un 3-dimensoluzione sionale NMDS. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Per ridurre al minimo ed evitare errori di interpretazione dei dati PLFA, attento screening dei dati deve essere fatto perché alcuni PLFAs che si trovano nella comunità microbica del suolo sono presenti negli organismi eucarioti singole e multicellulari, come le radici delle piante, alghe e animali terreno anche. Inoltre, Archaea non contengono PLFAs; invece, membrane archeali sono costituiti da fosfolipidi lipidi etere (PLELs). Di conseguenza, il protocollo PLFA non può essere utilizzato per caratterizzare comunità archeali nel suolo.

Associazione singoli PLFAs a specifici gruppi microbici deve essere esercitata con cautela (vedere la pubblicazione 2011 da Frostegård e colleghi 34 per un eccellente discussione di alcuni dei limiti del metodo PLFA). Invece, può essere più appropriato, come è stato fatto nella figura 2, per PLFAs gruppi in base alla loro struttura chimica, ad esempio, i) PLFAs saturi a catena lineare, ii) PLFAs saturi con mid-chain (10-metil) ramificate, acidi grassi saturi iii) terminali-ramificati, IV) PLFAs monoinsaturi, v) PLFAs polinsaturi, e VI) acidi grassi idrossiacidi.

peso del campione può avere bisogno di essere regolata in base alla quantità di PLFAs estraibili contenuti in un determinato campione di suolo. Evitando di regolare la quantità di terreno estratto nei suoli attivi meno microbi, gli utenti sono a rischio di non ottenere un numero sufficiente di risposte PLFA (picchi) per rappresentare accuratamente la comunità microbica complessiva. In terreni altamente microbiologicamente attivi con elevate concentrazioni di PLFAs, gli utenti sono a rischio di sovraccaricare la colonna GC, impedendo in tal modo la quantificazione precisa della PLFAs. In entrambi i casi, i campioni di suolo devono essere nuovamente analizzati per PLFAs. Un buon punto di partenza è quello di aggiungere 0,5 g di campioni di suolo organici (come i pavimenti delle foreste), e circa 3 g di campioni di terreno minerali. Poiché la quantità di PLFAs estraibili è tipicamente correlata alla quantità di carbonio organico contenuto in un terreno, abbiamo campioneestra può essere regolato in base al contenuto di carbonio del suolo, ad esempio, 1 g di campione di terreno minerale può essere sufficiente per ottenere una buona quantificazione PLFA quando il contenuto di carbonio è del 10-15%, mentre> 5 g può essere necessaria se il contenuto di carbonio è ≤ 0,5 %. E 'sempre una buona idea per fare un giro di prova con alcuni campioni per ottimizzare il peso del campione prima che l'intero set viene eseguito.

strategie di risoluzione dei problemi comuni per il protocollo PLFA e l'analisi GC sono i seguenti. Se la linea di base GC cromatogramma è troppo alta, la bombola del gas H 2 deve essere cambiato. Se i picchi di solvente o ISTD mancano dal cromatogramma, ci potrebbe essere un problema con iniezione del campione (ad esempio, collegato siringa, problema con campionatore automatico, fiala vuota o mancante, errori di posizionamento flaconcino). Se vengono rilevate più di tre picchi nel vuoto metodo / campione, c'è contaminazione del vuoto, e vi è un'alta probabilità che lo stesso contaminante (s) sarà presente nel campione GC chromatograms. Trovare la fonte di contaminazione (supporti solito acquosa), o per lo meno, assicurarsi che i picchi corrispondenti al contaminante vengono rimossi dai cromatogrammi di esempio e che questi picchi non sono inclusi in ogni analisi statistica dei dati PLFA. Inoltre, è una buona idea per eseguire esano risciacqua tra i campioni quando si sospetta riporto. Ulteriori picchi nel risciacquo esano indicheranno riporto (cioè componenti più pesanti eluizione dalla precedente esecuzione).

I lipidi sono particolarmente sensibili all'ossidazione, e particolare attenzione deve essere esercitato in tutto il protocollo per proteggere i campioni di esposizione all'aria e alla luce, come ad esempio la loro memorizzazione nel buio e tenerli sotto azoto. Tutti i campioni e gli spazi devono avere sufficienti C19: 0 standard surrogata. A C19 mancante: 0 picco, in entrambi i campioni o spazi vuoti, indica un povero recupero o una completa perdita di analiti. Una risposta di C19: 0 nei campioni che è notevolmente inferiore alla mgrezzi etodo / di esempio indica una perdita di analiti a un certo punto nella metodologia PLFA. Di fronte a scarsa C19: 0 di recupero, tutti gli aspetti del procedimento devono essere attentamente considerati ed esaminati compreso dell'estrazione iniziale, tutte le fasi di trasferimento del campione, estrazione SPE, metilazione acido grasso, essiccazione, stoccaggio e manipolazione del campione al fine di isolare il fase o fasi in cui si perdono analiti. D'altra parte, può essere che l'estrazione di alcuni campioni di terreno può produrre C19: 0, nel qual caso il recupero della norma surrogata può essere sovrastimato. Durante l'utilizzo di due standard ((PC (19: 0/19: 0) e MeC10: 0) non è un requisito assoluto, abbiamo trovato che questo è molto utile quando si ha bisogno per risolvere Finché il MeC10:. 0 risposta è adeguata , la risoluzione dei problemi può concentrarsi sui gradini prima dell'analisi GC.

Come indicato in precedenza, la cautela deve essere utilizzato nell'interpretazione ecologici di significatività e di ecosistema relazioni basate esclusivamente sui biomarcatori derivanod dai dati PLFA, perché gli studi coltura pura rivelano che isolati ceppi batterici conterranno diverse categorie di PLFAs. Invece, PLFAs biomarcatori devono essere considerati come un'utile aggiunta in una suite di prove, quando fare inferenze ecologici più ampi. In letteratura, singoli PLFAs sono state proposte ed utilizzate come marcatori per i diversi gruppi microbici. PLFAs saturi sono in genere utilizzati per rappresentare i batteri gram-positivi e monoinsaturi PLFA sono utilizzati per i batteri gram-negativi. biomarcatori riconosciuti per i batteri gram-negativi includono gli acidi grassi monoinsaturi con l'insaturazione al ω5 o la posizione ω7, come ad esempio C16: 1ω7, C18: 1ω7 e C18: 1ω5. Inoltre, acidi grassi ciclopropil possono anche essere rappresentativi di batteri gram-negativi 35. Quindi, PLFAs da batteri gram-negativi può essere calcolato come pari alla somma di A: 1ω5 + A: 1ω7 + A: 0cyclo. biomarcatori riconosciuti per i batteri gram-positivi sono terminali ramificati saGli acidi grassi turated, iso-ramificati, come C15: 0i, C16: 0i, C17: 0i; o anteiso-ramificati, come ad esempio C15: 0a e C17: 0a. Saturi PLFAs con mid-catena (10-metil) ramificazione, come ad esempio 10Me16: 0 e 10Me18: 0 sono tipicamente presenti in attinomiceti 36. Così, PLFAs da batteri gram-positivi possono essere calcolati come pari alla somma di A: 0 (ISO, ANTEISO, 10-metil).

Molti biomarcatori associati fungine PLFA sono spesso polinsaturi, ma alcuni biomarcatori fungine sono monoinsaturi. Per esempio, in termini di biomarcatori monoinsaturi fungine, C16: 1ω5 è stata identificata come un indicatore di funghi micorrizici arbuscolari (AMF) 37, C18: 1ω9 è comune nei funghi saprofiti, e ectomicorrize in genere contengono C16: 1ω9. La presenza di di-insaturi C18: 2ω6,9 verifica spesso in combinazione con C18: 1ω9 e correla bene anche con dell'ergosterolo steroli fungina, che indica che C18: 2ω6,9 può rappresentare adeguatamente ectomycorrhizae e funghi saprofiti 38. Il tri-insaturi C18: 3ω 6,9,12 è stato anche utilizzato come biomarker per i funghi 10; tuttavia, C18: 3ω6c può essere trovato in altri organismi eucarioti, tra cui piante e alghe, anche se è in genere non trovato nei batteri. In termini di protisti del suolo, C20: 4ω6c è stato riconosciuto come un biomarcatore protista 39, anche se, delle altre attività non è riuscito a rilevare C20: 4ω6c anche quando le popolazioni protisti vitali sono stati confermati visivamente mediante microscopia ottica 40.

Molti studi affrontano questioni ecologiche legate alla comunità globale microbica del suolo utilizzando tecniche di coordinamento multivariata come uno strumento di analisi dei dati PLFA. Quando si utilizza questo approccio, alcuni autori hanno scelto di escludere PLFAs rari dal set di dati rimuovendo PLFAs che sono presenti in meno del 5% dei campioni 4. Gli acidi grassi saturi normale C16: 0 e C18: 0 sono abbondanti in tutti i microrganismi del suolo, compresi i procarioti e EUKaryotes. Quindi, alcuni ricercatori scelgono di rimuovere questi PLFAs prima analisi statistica sulla base del fatto che essi non possono essere indicatori sensibili della composizione della comunità microbica del suolo – anche se C16: 0 e C18: 0 sono ancora da inserire quando sommando tutti PLFAs per un indice di biomassa microbica. In termini di analisi statistiche, molti ricercatori scelgono di condurre una scala multidimensionale (NMDS) ordinazione non metriche come questa tecnica è adatta a dati che non può essere distribuita normalmente 33. Ulteriori analisi relativi a variabili categoriali possono includere l'analisi specie indicatrici, che può riguardare il verificarsi di PLFAs specifici ai raggruppamenti categoriali e multi procedure di risposta di permutazione (MRPP), che possono aiutare a determinare somiglianze o differenze tra le comunità microbiche assegnati ai gruppi categoriali. Inoltre, gli alberi di regressione multivariata (MRT) può essere particolarmente utile quando l'influenza delle molteplici variabili sperimentali otrattamenti deve essere valutata come potenziali variabili esplicative 5 (ad esempio, la tessitura del suolo, l'umidità, l'età di bonifica).

Una volta stabilito, il protocollo PLFA è relativamente semplice metodo analitico che può essere molto utile quando quantificare terreno risposta microbica ai cambiamenti ambientali e di disturbo antropico. Mentre le tecniche molecolari, come impronte genetiche sono più adatti alla caratterizzazione dettagliata delle comunità microbiche, il metodo PLFA presenta il vantaggio di fornire informazioni quantitative sul totale biomassa microbica 34. Nel nostro laboratorio di ricerca, una persona in grado di elaborare comodamente un gruppo di 20 campioni su 4 giorni, e abbiamo trovato il protocollo presentato qui per essere una tecnica robusta e riproducibile per valutare la qualità biologica del suolo.

La forza del metodo PLFA può essere notevolmente ampliato con l'accoppiamento ad analisi degli isotopi stabili 41, 42. In particolare, oltre of 13 substrati C-marcato ai terreni consente la quantificazione del substrato incorporazione in microrganismi del suolo anche se l'analisi isotopica dei singoli PLFAs 41. Inoltre, questo metodo sembra essere uno strumento molto promettente per chiarire i collegamenti trofiche nel suolo alimentare reti 42.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was financed in part by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada. The authors acknowledge Jela Burkus, Donna Macey, and Jennifer Lloyd for their technical expertise and their contribution to the optimization of this method.

Materials

Pierce Reacti-Vap III-evaporator gassing manifold with 27 ports Used in Steps 1-3
Compressed Nitrogen Praxair Ni-T Dangerous: Use only after training and minimize contact and use; Used in Steps 1-3
Disposable centrifuge tube and Teflon-lined cap Fisher Scientific 05-569-3 Used for Step 1 (1 per sample) and Step 2 (1 per sample)
Disposable glass long-necked Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20D Used for Step 1 (2 per sample)
Disposable glass short-necked Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-4 Used for Step 2 (1 per sample), Step 3 (1 per sample), GC analysis (1 per sample),, and one for each type of solution dispensed during PLFA methods (~10 per batch of samples)
Elastic band Grand & Toy 42199 1 per sample for freeze drying
Freeze Dryer-Labconco 7806002 and 7753000 Used for preparing samples for PLFA analysis – use whatever model your lab has
Freezer (-20 °C, -80 °C) Revco ULT2586-5-A36 Minus 80 °C is used for freezing freshly collected soil samples, -20 °C is used for storing samples at end of each of 3 steps of PLFA analysis
Gas chromatograph – Agilent 6890 Series capillary gas chromatograph (GC;, Wilmington, DE) equipped with a 50 m Ultra 2 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane column Agilent Technologies Used for GC analysis, other models of GC could also be used (1 needed)
Analytical column Agilent Technologies 19091B-105
Gas chromatograph insert Agilent Technologies 5183-4692 Used for GC analysis (1 per sample)
Gas chromatograph vial and lid Agilent Technologies 5188-6592 Used for GC analysis (1 per sample)
Hexanes Fisher Scientific H292-4 Hazardous: use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3)
Hot water bath -Isotemp 220 Fisher Scientific Used for Step 3 (1 per batch of samples)
Kimwipe Fisher Scientific 06-666-2 Used for freeze drying samples
KOH,  ACS grade Fisher Scientific P250-500 Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Used for making citrate buffer (used in Step 1) and methanolic KOH (step 3)
Lab quake end-over-end shaker for centrifuge tubes Barnstead/Thermolyne 3,625,485 Used for Step 1 (1 per batch of samples of appropriate holding capacity)
MeC10:0 methyl decanoate internal standard Sigma-Aldrich 299030-2.5G Used for GC analysis
Methanol Fisher Scientific A454-4 Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (step 1) + 5 ml (step 2) + 0.5 ml (step 3))
MIDI Peak Identification Software MIDI, Inc., Newark, DE Used for interpreting GC analysis output
MIDI Calibration Standard Mix for Microbial Identification System Lab Sphere Inc 1200-A Used as a Calibration mix for TSBA 40
Nitrile gloves Fisher Scientific 27-058-52 Used always when conducting PLFA lab work
pH Meter – Accumet XL200 Fisher Scientific Used for making citrate buffer
Pipette (0.2 – 2 ml)- Socorex -Calibra Digital 832 Macropipette Socorex 832.02 Used throughout Steps (1 per sample)
250 µL gastight syringe Hamilton  1725 Used for GC analysis (1 per sample)
silver shield gloves Sigma-Aldrich Z529575 For use when handling chloroform
solid phase extraction (SPE) column Agilent Technologies 5982-2265 Used for Step 2 (1 per sample)
SPE glass column holder with spigots  and vacuum apparatus attached Sigma-Aldrich Used for Step 2 (1 per batch of samples)
Vortex – Barnstead International Maxi Mix II- M37615 Barnstead International  M37615 Used in Steps 1-3
Water -  ultra-pure and Chromosolv HPLC grade Sigma-Aldrich 270733-4L Used throughout analysis
Whirl-Pak® bags Fisher Scientific 01-812-120 Used in sample collection – 2 bags required per sample collected
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Quideau, S. A., McIntosh, A. C., Norris, C. E., Lloret, E., Swallow, M. J., Hannam, K. Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils. J. Vis. Exp. (114), e54360, doi:10.3791/54360 (2016).
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