Externe Anregung von Neuronen mittels elektrische und magnetische Felder in One- und Zweidimensionale Kulturen
Summary
Neuronale Kulturen sind ein gutes Modell für die Untersuchung Schwellen Hirnstimulation Techniken über ihre Wirkung auf die einzelnen Neuronen oder einer Population von Neuronen. Dargestellt hier sind verschiedene Verfahren zur Stimulation von gemusterten neuronalen Kulturen durch ein elektrisches Feld erzeugt wird direkt durch Badelektroden oder induziert durch ein zeitlich veränderliches Magnetfeld.
Abstract
Ein Neuron wird ein Aktionspotential ausgelöst, wenn dessen Membranpotential einen bestimmten Schwellenwert überschreitet. In typischer Aktivität des Gehirns, tritt dies als Ergebnis chemischer Eingänge seine Synapsen. Allerdings Neuronen können auch durch ein auferlegtes elektrisches Feld angeregt werden. Insbesondere aktivieren bisherige klinische Anwendungen Neuronen, die durch ein elektrisches Feld von außen zu schaffen. Es ist daher von Interesse, zu untersuchen, wie das Neuron zum äußeren Feld reagiert und was bewirkt, dass das Aktionspotential. Glücklicherweise ist eine präzise und kontrollierte Anwendung eines externen elektrischen Feldes möglich ist, für die embryonale neuronale Zellen, die herausgeschnitten werden, dissoziiert und in Kulturen gezüchtet. Dies ermöglicht die Untersuchung dieser Fragen in hochreproduzierbarer System.
In diesem Papier einige der Techniken für die kontrollierte Anwendung von externem elektrischem Feld auf neuronalen Kulturen verwendet werden, überprüft. Die Netzwerke können entweder eindimensional sein, dh in linea gemustertr Formen oder auf der gesamten Ebene des Substrats wachsen gelassen, und somit zweidimensional. Darüber hinaus kann die Anregung durch das direkte Anlegen des elektrischen Feldes über die Elektroden in dem Fluid (Badelektroden) oder durch Induzieren des elektrischen Felds unter Verwendung der Fern Schaffung magnetischer Impulse erzeugt wird eingetaucht.
Introduction
Die Wechselwirkung zwischen Neuronen und externen elektrischen Feldern hat sowohl grundlegende Implikationen als auch praktische. Während es seit den Zeiten von Volta bekannt ist, dass ein extern angelegtes elektrisches Feld Gewebe anregen kann, sind die Mechanismen, die für die Produktion eines resultierenden Aktionspotentials in Neuronen verantwortlich sind, erst vor kurzem aufgefangen 1 , 2 , 3 , 4 . Hierbei handelt es sich um Antworten auf Fragen, die den Mechanismus betreffen, der die Depolarisation des Membranpotentials, die Rolle der Membraneigenschaften und der Ionenkanäle und sogar die Region im Neuron, die auf das elektrische Feld 2 , 5 reagiert, verursacht. Therapeutische Neurostimulation 6 , 7 , 8 , 9 , <supclass = „xref“> 10 Methoden sind besonders abhängig von diesen Informationen, die für die Ausrichtung der betroffenen Gebiete von entscheidenden Bedeutung sein kann und das Ergebnis der Therapie für das Verständnis. Ein solches Verständnis kann auch helfen, Behandlungsprotokolle und neue Ansätze zur Stimulation verschiedenen Bereiche im Gehirn zu entwickeln.
Messen der Wechselwirkung innerhalb des in – vivo – Gehirns fügt eine wichtige Komponente dieses Verständnisses, sondern wird durch die Ungenauigkeit und niedrige Steuerbarkeit der Messungen innerhalb des Schädels behindert. Im Gegensatz dazu können die Messungen in den Kulturen mit hohen Präzision leicht, exzellenten Signal-Rausch-Leistung und einem hohen Grad an Reproduzierbarkeit und der Kontrolle in hohem Volumen durchgeführt werden. Mit Kulturen eine große Vielfalt von neuronalen Eigenschaften des kollektiven Verhalten des Netzwerks können 11 aufgeklärt werden, 12, 13, 14, </sup> 15, 16. In ähnlicher Weise ist dies gut kontrolliert werden , um hocheffiziente System erwartet , dass der Mechanismus in Aufklären , durch die anderen Stimulationsverfahren arbeiten, wie zum Beispiel Kanalöffnung während der optischen Stimulation in optogenetically aktiven Neuronen 17, 18, 19 ist verantwortlich für die Erstellung von Aktionspotential.
Hier liegt der Schwerpunkt auf der Beschreibung der Entwicklung und das Verständnis von Werkzeugen, die effizient das Neuron über ein externes elektrisches Feld anregen kann. In diesem Papier beschreiben wir die Herstellung von zweidimensionaler und eindimensionalen gemusterten hippocampalen Kulturen, Stimulation verschiedene Konfigurationen und Orientierung eines direkt angelegten elektrischen Feld von Badelektroden verwenden und schließlich Stimulation von zweidimensionalen und bemustert eindimensionalen Kulturen nach a zeitlich veränderliches Magnetfeld, das ein elektrisches Feld induziert,5, 20, 21.
Protocol
Representative Results
Discussion
1D Musterung ist ein wichtiges Werkzeug, das für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden kann. Zum Beispiel haben wir 1D Musterung für die Erstellung von Logikgattern aus neuronalen Kulturen 29 und in jüngerer Zeit zu messen , die Chronaxie und die Rheobase von Ratten – Hippocampus – Neuronen 5, und die Verlangsamung der Signalausbreitungsgeschwindigkeit des Brennen Aktivität in Down – Syndrom – Hippocampus – Neuronen im Vergleich zu dem verwendeten Wildtyp (WT…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Ofer Feinerman, Fred Wolf, Menahem Segal, Andreas Neef und Eitan Reuveny für sehr hilfreiche Diskussionen. Die Autoren danken Ilan Breskin und Jordi Soriano für frühe Versionen der Technologie zu entwickeln. Die Autoren danken Tsvi Tlusty und Jean-Pierre Eckmann für die Hilfe bei den theoretischen Konzepten. Diese Forschung wurde von der Minerva-Stiftung, das Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Israel, und Israel Science Foundation Grant 1320-1309 und die Bi-National Science Foundation Grant 2.008.331 unterstützt.
Materials
| APV | Sigma-Aldrich | A8054 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| B27 supp | Gibco | 17504-044 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| bicuculline | Sigma-Aldrich | 14343 | Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2 |
| Borax (sodium tetraborate decahydrate) | Sigma-Aldrich | S9640 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| Boric acid | Frutarom LTD | 5550710 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| CaCl2 , 1M | Fluka | 21098 | Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2 |
| COMSOL | COMSOL Inc | Multiphysics 3.5 | Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2 |
| D-(+)-Glucose, 1M | Sigma-Aldrich | 65146 | Plating medium, Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.1.1 1.5.2 |
| D-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Cell Cultures. Mentioned in Section 1.2.4 1.2.6 |
| FCS(FBS) | Gibco | 12657-029 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| Fluo4, AM | Life technologies | F14201 | Imaging of spontaneous or evoked activity . Mentioned in Section 1.5.1 1.5.3 1.5.5 |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| GlutaMAX 100X | Gibco | 35050-038 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Hepes, 1M | Sigma-Aldrich | H0887 | Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2 |
| HI HS | BI | 04-124-1A | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 1.4.1 1.4.2 |
| KCl, 3M | Merck | 1049361000 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| MEM x 1 | Gibco | 21090-022 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1 1.4.2 |
| MgCl2 , 1M | Sigma-Aldrich | M1028 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| NaCl, 4M | Bio-Lab | 19030591 | Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2 |
| Octadecanethiol | Sigma-Aldrich | 01858 | Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3 |
| Pluracare F108 NF Prill | BASF Corparation | 50475278 | Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.4 1.2.6 |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma-Aldrich | P47075 | Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4 |
| Sucrose, 1M | Sigma-Aldrich | S1888 | Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2 |
| Thiol | Sigma-Aldrich | 1858 | Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3 |
| URIDINE | Sigma-Aldrich | U3750 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Sputtering machine | AJA International, Inc | ATC Orion-5Series | coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2 |
| Pen plotter | Hewlett Packard | HP 7475A | Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5 |
| Electrodes wires | A-M Systems, Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1 2.2 2.3 2.4.5 |
| Signal generator | BKPrecision | 4079 | Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3 |
| Amplifier | Homemade | Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3 | |
| Power supply | Matrix | MPS-3005 LK-3 | Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3 |
| Transcranial magnetic stimulation | Magstim, Spring Gardens, UK | Rapid 2 | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.1 3.3 3.4 |
| Epoxy | Cognis | Versamid 140 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Epoxy | Shell | EPON 815 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems, | Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1 |
| Circular magnetic coil | Homemade | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3 | |
| WaveXpress SW | B&K Precision | Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32 | |
| Xion Ultra 897 | Andor | Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4 |
References
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