Excitação externa de Neurônios Usando Campos Elétricos e Magnéticos em One e culturas bidimensionais
Summary
culturas neuronais são um bom modelo para o estudo de técnicas emergentes de estimulação do cérebro através de seus efeitos sobre os neurônios individuais ou uma população de neurônios. Aqui apresentados são diferentes métodos para a estimulação de culturas neuronais modeladas por um campo eléctrico produzido directamente por eléctrodos de banho ou induzida por um campo magnético variável no tempo.
Abstract
Um neurónio irá disparar um potencial de acção, quando o seu potencial de membrana excede um determinado limiar. A actividade típica do cérebro, isto ocorre como resultado de entradas químicos às suas sinapses. No entanto, os neurônios também pode ser excitado por um campo eléctrico imposto. Em particular, aplicações clínicas recentes ativar os neurônios, criando um campo elétrico externo. Por isso, é de interesse para investigar como o neurônio responde ao campo externo eo que faz com que o potencial de ação. Felizmente, a aplicação precisa e controlada de um campo eléctrico externo é possível que as células neuronais embrionárias que são excisados, dissociadas e cultivadas em culturas. Isso permite que a investigação dessas questões em um sistema altamente reprodutível.
Neste artigo algumas das técnicas utilizadas para aplicação controlada de campo elétrico externo em culturas neuronais são revistos. As redes podem ser unidimensional, ou seja padronizado em lineaformas R ou deixadas a crescer em todo o plano do substrato, e, assim, bidimensional. Além disso, a excitao pode ser criada por aplicação directa do campo eléctrico através de eléctrodos imersos no fluido (eléctrodos de banho) ou através da indução do campo eléctrico utilizando o criação remota de impulsos magnéticos.
Introduction
A interacção entre os neurónios e os campos eléctricos externos tem implicações fundamentais, bem como os práticos. Embora seja conhecido desde os tempos de Volta que um campo eléctrico aplicado externamente pode excitar tecido, os mecanismos responsáveis para a produção de um potencial de acção resultante em neurónios são apenas recentemente começando a ser desvendado 1, 2, 3, 4. Isto inclui encontrar respostas a perguntas sobre o mecanismo que causa despolarização do potencial de membrana, o papel das propriedades da membrana e de canais iônicos, e até mesmo a região do neurônio que reage ao campo elétrico 2, 5. Terapêutico neuro 6, 7, 8, 9, <sup10 metodologias são particularmente dependentes desta informação, que pode ser crucial para a segmentação das áreas afectadas e para a compreensão dos resultados da terapia. Essa compreensão também pode ajudar no desenvolvimento de protocolos de tratamento e novas abordagens para estimulação de diferentes áreas do cérebro.
A medição da interação dentro do cérebro in vivo acrescenta um componente importante a esta compreensão, mas é dificultada pela imprecisão e baixa controlabilidade das medições dentro do crânio. Em contraste, as medições em culturas podem ser facilmente realizadas em alto volume com alta precisão, excelente desempenho sinal-ruído e um alto grau de reprodutibilidade e de controle. Usando culturas uma grande variedade de propriedades neuronais do comportamento coletivo da rede pode ser elucidada 11 , 12 , 13 , 14 , </sup> 15, 16. De igual modo, este sistema é bem controlada esperado ser altamente eficientes para elucidar o mecanismo pelo qual outros métodos de estimulação trabalhar, por exemplo, como a abertura do canal durante a estimulação óptica em neurónios optogenetically activas 17, 18, 19, é responsável pela criação de potencial de acção.
Aqui, o foco está em descrever o desenvolvimento e compreensão das ferramentas que podem eficientemente excitam o neurônio através de um campo elétrico externo. Neste documento descreve-se a preparação de bidimensional e unidimensional culturas de hipocampo estampados, estimulação utilizando diferentes configurações e orientação de um campo eléctrico aplicado directamente por eléctrodos de banho, e, finalmente, a estimulação da bidimensional e modelado culturas unidimensionais por um tempo variando no campo magnético, o que induz um campo eléctrico5, 20, 21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Padrão 1D é uma ferramenta importante que pode ser usado para uma variedade de aplicações. Por exemplo, utilizamos padrões 1D para criar portas lógicas a partir de culturas neuronais 29 e mais recentemente para medir o Chronaxie e Rheobase de neurônios do hipocampo de ratos 5 e a desaceleração da velocidade de propagação de sinal da atividade de disparo em neurônios do hipocampo de síndrome de Down em comparação com a Neurônios do hipocampo do tipo selvagem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem Ofer Feinerman, Fred Wolf, Menahem Segal, Andreas Neef e Eitan Reuveny para discussões muito úteis. Os autores agradecem Ilan Breskin e Jordi Soriano para o desenvolvimento de versões iniciais da tecnologia. Os autores agradecem a Tsvi Tlusty e Jean-Pierre Eckmann pela ajuda com os conceitos teóricos. Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Minerva, o Ministério da Ciência e Tecnologia, Israel, e pela Fundação Ciência de Israel subvenção 1320/09 e da Fundação Bi-Ciência Fundação 2008331.
Materials
| APV | Sigma-Aldrich | A8054 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| B27 supp | Gibco | 17504-044 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| bicuculline | Sigma-Aldrich | 14343 | Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2 |
| Borax (sodium tetraborate decahydrate) | Sigma-Aldrich | S9640 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| Boric acid | Frutarom LTD | 5550710 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| CaCl2 , 1M | Fluka | 21098 | Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2 |
| COMSOL | COMSOL Inc | Multiphysics 3.5 | Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2 |
| D-(+)-Glucose, 1M | Sigma-Aldrich | 65146 | Plating medium, Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.1.1 1.5.2 |
| D-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Cell Cultures. Mentioned in Section 1.2.4 1.2.6 |
| FCS(FBS) | Gibco | 12657-029 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| Fluo4, AM | Life technologies | F14201 | Imaging of spontaneous or evoked activity . Mentioned in Section 1.5.1 1.5.3 1.5.5 |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| GlutaMAX 100X | Gibco | 35050-038 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Hepes, 1M | Sigma-Aldrich | H0887 | Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2 |
| HI HS | BI | 04-124-1A | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 1.4.1 1.4.2 |
| KCl, 3M | Merck | 1049361000 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| MEM x 1 | Gibco | 21090-022 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1 1.4.2 |
| MgCl2 , 1M | Sigma-Aldrich | M1028 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| NaCl, 4M | Bio-Lab | 19030591 | Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2 |
| Octadecanethiol | Sigma-Aldrich | 01858 | Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3 |
| Pluracare F108 NF Prill | BASF Corparation | 50475278 | Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.4 1.2.6 |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma-Aldrich | P47075 | Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4 |
| Sucrose, 1M | Sigma-Aldrich | S1888 | Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2 |
| Thiol | Sigma-Aldrich | 1858 | Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3 |
| URIDINE | Sigma-Aldrich | U3750 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Sputtering machine | AJA International, Inc | ATC Orion-5Series | coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2 |
| Pen plotter | Hewlett Packard | HP 7475A | Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5 |
| Electrodes wires | A-M Systems, Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1 2.2 2.3 2.4.5 |
| Signal generator | BKPrecision | 4079 | Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3 |
| Amplifier | Homemade | Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3 | |
| Power supply | Matrix | MPS-3005 LK-3 | Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3 |
| Transcranial magnetic stimulation | Magstim, Spring Gardens, UK | Rapid 2 | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.1 3.3 3.4 |
| Epoxy | Cognis | Versamid 140 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Epoxy | Shell | EPON 815 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems, | Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1 |
| Circular magnetic coil | Homemade | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3 | |
| WaveXpress SW | B&K Precision | Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32 | |
| Xion Ultra 897 | Andor | Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4 |
References
- Nagarajan, S. S., Durand, D. M., Warman, E. N. Effects of induced electric fields on finite neuronal structures: a simulation study. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (11), 1175-1188 (1993).
- Nowak, L. G., Bullier, J. Axons but not cell bodies, are activated by electrical stimulation in cortical gray matter. II. Evidence from selective inactivation of cell bodies and axon initial segments. Exp Brain Res. 118 (4), 489-500 (1998).
- Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Res. 98 (3), 417-440 (1975).
- Rattay, F. The basic mechanism for the electrical stimulation of the nervous system. Neuroscience. 89 (2), 335-346 (1999).
- Stern, S., Agudelo-Toro, A., Rotem, A., Moses, E., Neef, A. Chronaxie Measurements in Patterned Neuronal Cultures from Rat Hippocampus. PLoS One. 10 (7), e0132577 (2015).
- Brunelin, J., et al. Examining transcranial direct-current stimulation (tDCS) as a treatment for hallucinations in schizophrenia. Am J Psychiatry. 169 (7), 719-724 (2012).
- Cruccu, G., et al. EFNS guidelines on neurostimulation therapy for neuropathic pain. Eur J Neurol. 14 (9), 952-970 (2007).
- Kennedy, S. H., et al. Canadian Network for Mood and Anxiety Treatments (CANMAT) Clinical guidelines for the management of major depressive disorder in adults. IV. Neurostimulation therapies. J Affect Disord. 117, S44-S53 (2009).
- Minzenberg, M. J., Carter, C. S. Developing treatments for impaired cognition in schizophrenia. Trends Cogn Sci. 16 (1), 35-42 (2012).
- Vaidya, N. A., Mahableshwarkar, A. R., Shahid, R. Continuation and maintenance ECT in treatment-resistant bipolar disorder. J ECT. 19 (1), 10-16 (2003).
- Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. II. Synaptic relationships. J Neurosci. 4 (8), 1954-1965 (1984).
- Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. I. Cells which develop without intercellular contacts. J Neurosci. 4 (8), 1944-1953 (1984).
- Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches in neocortical circuits. J Neurosci. 23 (35), 11167-11177 (2003).
- Breskin, I., Soriano, J., Moses, E., Tlusty, T. Percolation in living neural networks. Phys Rev Lett. 97 (18), (2006).
- Feinerman, O., Moses, E. Transport of information along unidimensional layered networks of dissociated hippocampal neurons and implications for rate coding. J Neurosci. 26 (17), 4526-4534 (2006).
- Soriano, J., Rodriguez Martinez, ., Tlusty, M., T, E., Moses, Development of input connections in neural cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (37), 13758-13763 (2008).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
- Williams, S. C., Deisseroth, K. Optogenetics. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16287 (2013).
- Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of curved nerves. IEEE Trans Biomed Eng. 53 (3), 414-420 (2006).
- Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of one-dimensional neuronal cultures. Biophys J. 94 (12), 5065-5078 (2008).
- Feinerman, O., Moses, E. A picoliter ‘fountain-pen’ using co-axial dual pipettes. J Neurosci Methods. 127 (1), 75-84 (2003).
- Feinerman, O., Segal, M., Moses, E. Signal propagation along unidimensional neuronal networks. J Neurophysiol. 94 (5), 3406-3416 (2005).
- Papa, M., Bundman, M. C., Greenberger, V., Segal, M. Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 1-11 (1995).
- Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. J Physiol. 557 (1), 175-190 (2004).
- Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. J Physiol. 591 (10), 2563-2578 (2013).
- Stern, S., Segal, M., Moses, E. Involvement of Potassium and Cation Channels in Hippocampal Abnormalities of Embryonic Ts65Dn and Tc1 Trisomic Mice. EBioMedicine. 2 (9), 1048-1062 (2015).
- Rotem, A., et al. Solving the orientation specific constraints in transcranial magnetic stimulation by rotating fields. PLoS One. 9 (2), e86794 (2014).
- Feinerman, O., Rotem, A., Moses, E. Reliable neuronal logic devices from patterned hippocampal cultures. Nat Phys. 4 (12), 967-973 (2008).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
- Bugnicourt, G., Brocard, J., Nicolas, A., Villard, C. Nanoscale surface topography reshapes neuronal growth in culture. Langmuir. 30 (15), 4441-4449 (2014).
- Roth, S., et al. Neuronal architectures with axo-dendritic polarity above silicon nanowires. Small. 8 (5), 671-675 (2012).
- Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
- Renault, R., et al. Combining microfluidics, optogenetics and calcium imaging to study neuronal communication in vitro. PLoS One. 10 (4), e0120680 (2015).
- Roth, B. J., Basser, P. J. A model of the stimulation of a nerve fiber by electromagnetic induction. IEEE Trans Biomed Eng. 37 (6), 588-597 (1990).
