偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層​​を持つシングルプロテオリポソー​​ムのSNARE媒介性の融合

膜融合は、細胞内の脂質とタンパク質の輸送、分泌、受精、発育、および宿主生物^1-3へのウイルスの侵入をエンベロープするために必要な普遍的生物学的プロセスです。エキソサイトーシスを介したホルモンや神経伝達物質の放出を含むほとんどの細胞内の核融合反応では、2つの脂質二重層を融合させるエネルギーが内に固定、同族可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体 （SNARE）タンパク質間の4ヘリックスバンドルの形成によって提供されています小胞（V-SNARE）及び標的膜^{（T-SNARE）4、。}シナプス小胞のエキソサイトーシスは、最も厳密に制御核融合反応であり、活動電位^1,4,5の到着後ミリ秒以内に行われます。融合孔、2融合区画間の最初の接続は、オープンちらつきおよび再密封または^5-7不可逆的に拡大する前に複数回を閉じすることができます。前者の結果過渡、「キス＆ラン」の融合で、完全な融合に後者リードしながら。これら2つの融合のモードと細孔のちらつきを調整する機構との間のバランスを支配する要因はよく^5,8を理解されていません。

SNAREタンパク質は、エキソサイトーシスのために必要とされます。シナプス小胞の融合は、神経毒⁹でのSNAREの切断の際に廃止されています。小さ ​​な単層ベシクル（SUV車）を使用してバルク融合実験は、膜融合^10を駆動するのに十分のSNAREのみが必要とされないことを示したが、。このバルクアッセイでは、V字のSNARE（V-SUV）で再構成のSUVは、蛍光リン脂質（Nでドープされた- （7-ニトロ2-1,3-benzoxadiazol -4-イル）-phosphoethanolamine（NBD-PE）及び（ N – 。（リサミンローダミンBスルホニル）-phosphoethanolamine（LR-PE）およびt-SNAREと（T-SUV）を含む非標識小胞と混合当初のv-SUV車でNBD-PEの蛍光は蛍光共鳴エネルギー移動により消光される（FRET ）LR-PEへ。研究室として、ELED V-SUVが非標識T-SUV車と融合、今組み合わせた膜中の蛍光体表面密度が減少し、NBD-PEの蛍光の結果の増加は、脂質が^10を混合の程度を報告します。バルクアッセイがセットアップし、分析することが容易であるように、広くSNARE媒介融合^10-14のメカニズムを研究するために使用されています。しかし、そのような低感度と悪い時間分解能など、いくつかの制限を有します。ドッキングおよび融合との識別だけでなく、困難なhemifusion中間体の検出を行うすべてのイベントで最も重要なのは、アンサンブル測定など、その平均値をもたらします。

私たちを含め、過去十年間、いくつかのグループ、の上、単一小胞レベル^15-27で融合イベントを監視するための新しいアッセイを開発しました。ハらは、表面に係留さV-SUV車を使用し、無料のT-SUV車^18,19との融合を監視しました。脂質混合は脂質結合蛍光団のemのペア間のFRETを用いてモニターしました全内部反射蛍光（TIRF）顕微鏡^18を用いて、それぞれ、VおよびTのSUVにベッド。その後、Brungerの研究室では、脂質と内容が^20,28の混合の同時検出のためのコンテンツマーカーと一緒に単一の脂質ラベル種を使用しました。脂質およびコンテンツマーカーの両方が高い、自己消光濃度で含まれていました。非標識のSUVとの融合は^、20,28の脱消光蛍光をもたらしました。

その他がt-SNAREと^{15-17,21-27,29}で再構成平面二重層にV-のSUVを融合させています。ターゲットの平面形状（T-SNARE含む）二重層より良い模倣フラット形質膜と小、大きく湾曲した小胞の生理的な融合プロセスを。 T-のSNAREで再構成細孔貫通膜を用いスタイネム基は、多孔質窒化ケイ素基板上に懸濁させ、共焦点レーザー走査顕微鏡^23を使用して個々 ^の V-SUV車との融合を検出しました。その他FT-SNAREとで再構成平面二重層するために使用されるV-SUVが、ガラス基板^{15-17,21,22,24-27,29}でサポートされています。サポートされている二重層（SBLs）を使用することの大きな利点は、マイクロフルイディクスを使用しても使用してシングルイベント分解能を提供するが、TIRF顕微鏡法は、優れた信号対雑音比と、無料V-SUV車からの干渉なしにドッキングおよび融合事象を検出するために使用することができるということです標準の遠視野落射蛍光顕微鏡^24。

主な関心事は、どのように基板-二重層相互作用がサポートされている二重層の品質と融合プロセスに影響を与えるかどうかです。初期の研究は、直接ガラスや石英基板^15-17でサポートされていました平面SBLsを利用しました。これらSBLsは、基板上に拡散し、T-SUV膜の融合、破裂、吸着することによって作製しました。これは、すぐにキートン-SNAREコンポーネントを省略し、SNAP25は、このようにして調製SBLsからのv-SUVのドッキングおよび融合反応速度indistinguisをもたらしたこと、しかし、実現しました完全なT-SNAREと^17を使用して得られたものからhable。 SNAP25は絶対に生体内 ^30,31 に融合するために必要とされるので、これらの初期の試みの生理学的関連性は疑問に入れました。タムのグループは、より良好に制御サポート二重層形成^21を使用することで、この課題を克服しました。これは、T-SUV車²¹と、その単分子膜の融合が続くSBLのタンパク質を含まない最初のリーフレット、ためにラングミュア-ブロジェット堆積を使用していました。これは、SNAP25依存融合をもたらしました。

直接ラングミュア-ブロジェット法を使用することなく、ガラス基板上に支持二重層に関連する潜在的なアーチファクトを避けるために、Karatekin らは 、二重層と基板²⁴との間に柔らかい、水和したポリ（エチレングリコール）（PEG）クッションを導入しました。この変形例はまた、SNAP25依存融合²⁴を生じました。軟質ポリマー層上にクッション二層は、より良好な貫通を維持することが知られていましたタンパク質の移動度と機能^32、およびウイルス³³との融合の研究で使用されていました。また、PEG化された二重層は、自己治癒すると^34,35非常に堅牢であるにいくつかの能力を保持するように見えます。まず、市販の、脂質結合PEG鎖の画分は、T-SUV膜に含まれています。これらのT-SUVのバーストと、ガラス基板上に平面二重層を形成する場合、PEGブラシは、平面二重層の両方の弁尖を覆います。平面二重層の形成は親水性のガラス表面上のT-SUV車の周囲のPEG鎖の付着によって駆動されるので、リポソームの破裂及び平面二重層の形成は、使用される脂質組成物に対して比較的鈍感です。コレステロールの大量に含まれている場合しかし、SUV車の凝集性を増加させる、SUVが自然に破裂しないことができます。この場合、浸透圧ショック、又は二価のイオンは、平面二重層の形成^25を助けるために使用することができます。

このAPに、上記のようにPEGブラシが平面の両側をカバーローチ、二重層を支持しました。マイクロ流体流路に面するブラシはまた、通常、PEGの層で覆われている着信V-SUV車の非特異的付着を防止するのに役立ちます。 V-とt-SNARE複合体の形成は、膜近位領域³⁶に向かって段階的に膜遠位N末端 ​​および進行から始まります。 V-SUV車がt-SBL、V-およびアッセイの条件下でケースのように思われるPEGブラシ、上に突出するT-SNARE N末端必要とやり取りするために。ブラシの高さは、PEG化脂質の濃度及びPEG鎖長^37,38を変化させることによってのSNARE以外のタンパク質を研究するために適合させることができます。融合二重層の近位表面を覆うPEGブラシのもう1つの利点は、平方ミクロン³⁹あたり30,000〜40,000内在性膜タンパク質で充填されている生体膜の混雑した環境を模倣することです。ただ、このアッセイにおけるPEG鎖のように、repu生体膜をカバーlsiveタンパク質層が発生する核融合のための2つのリン脂質二重層の間の接触を可能にするために脇にプッシュする必要があります。

彼らはユニークな利点を提供するように、マイクロ流体流路は、このアッセイで使用されています。まず、マイクロ流体の流れがt-SBLを形成するために拡散し、融合するT-SUV車のより均一な成膜を可能にします。第二に、小さなチャネル容量（<1μl）をサンプルの消費を最小限に抑えます。第三に、必要な少量は、全実験は一定流量下で行うことを可能にします。流れは、弱いSBL ¹⁶からおそらく非特異的に、付着したV-のSUVを削除します。また、動力学的分析^17を簡素化^し 、T-SBLの上のv-SUV車の一定の密度を維持します。最後に、ドッキングされた小胞は、簡単に流れ²⁵によって運ばれる無料のものと区別されています。第四に、いくつかのマイクロ流体チャネルは、各々が異なる状態をプロービング、同じカバーガラス上で使用することができます。これは、条件ドゥリの比較を可能にします同じ実験ランをngの。同様のアプローチは、インフルエンザウイルスとクッションSBLs ³³との間の融合を研究するためにバンOijenグループが使用されてきました。

TIRF顕微鏡では、（〜100 nmの減衰定数を持つ）エバネセント場の指数関数的減衰は、ガラスバッファインタフェースの非常に近接している分子に蛍光励起を閉じ込めます。これは、遠く離れている蛍光分子の寄与を最小にする信号対雑音比を増加させ、10〜40ミリ秒のフレームの露光時間を有する単一分子感度を可能にします。エバネッセント場はまた、融合時の信号の増加につながる：SBLへのSUVからの標識脂質転送として、彼らはより強力な励起場で、平均して、自分自身を見つけます。蛍光の増加は、より大きなリポソームのために強いです。

偏光がエバネッセント場を生成するために使用される場合、付加的な効果は、T際の蛍光の変化に寄与するSBLへのSUVからのラベルのransfer。いくつかの脂質染料は、それらが埋め込まれた二層に対して好適な平均の角度で配向遷移双極子を持っています。偏光ビームが異なる二つの膜に色素を励起するので、これは、彼らがSBL 対 SUVにあるときに蛍光団によって放出される蛍光量の差を作成します。後者のために、双極子の向きが平坦SBLジオメトリによって制限される一方、前者の場合、励起光は、球状のSUVの周りに配向遷移双極子と相互作用します。染料は、膜^29,40の脂質色素遷移双極子配向並列用SUVよりもSBLにあるとき、例えば、s偏光（入射面に垂直な偏光）の入射光を用いる場合には、励起がより効率的です（そのようなのDiIのことやDID ^41-43など）。このような蛍光体でドープされたSUVは、ときにドックSBL（ 図7、Representatに暗く表示されますアイブ結果）。融合孔が開き、SUVとSBL膜を接続するように、蛍光プローブは、SBL内に拡散し、s偏光エバネッセント場^25,27,29によって励起される可能性が高くなります。その結果として、融合部位の周囲に統合蛍光シグナルは、SBL ^27（ 図3及び図7）にSUVの色素転写中に急激に増加します。 SBLに移す際に、それらが希釈されるように融合を伴う変更を知らせるために貢献する追加の要因は、蛍光標識の脱消光です。なぜなら小さな割合のみ（脱消光の寄与は、ここに記載されたアッセイにおけるエバネッセント場の減衰や偏光効果に比べて、通常軽微であります ）脂質のは標識されています。

融合時のシグナル増加は、時間を比較することにより、融合細孔特性を推定するために利用することができ、1 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg "/>、脂質は実際の解放時間に脂質が自由に透過性である細孔を通って脱出するために必要な、 。二つの時間スケールが同等である場合、細孔が脂質流れに対してほとんど抵抗を示すと結論されます。実際の放出時間が長い拡散制限のリリースのための時間よりも大幅にある場合は、これは脂質の放出を遅らせる、このような細孔ちらつきとして、プロセスを示すであろう。拡散制限解除時間、 、定着リポソームおよび脂質拡散の大きさに依存します。その推定は、これら2つのパラメータを定量化することが必要です。アッセイの単一分子感度は、脂質拡散率は、すべての融合イベント²⁶用SBLへのそれらのリリース後に、いくつかの単一の脂質の蛍光団を追跡することにより測定することができます。すべての融合小胞の大きさ（I）単脂質色素の強度、SUVの（ii）のすべてのフルオロフォアが融合時SBLに転送された後、ドッキング部位の周囲の合計の蛍光の変化、（III）は、公知の標識密度を組み合わせることにより^、27を推定することができます脂質、および（iv）脂質当たりの面積。均一なSUVのサイズ^44を想定^して先に述べたように、多くの融合イベントでは、実際の脂質の放出時間は、拡散制御放出²⁷で予想よりはるかに遅いことが判明しました。脂質リリースの遅延がちらつき細孔によるものであると仮定すると、定量的なモデルは「ポア開放性」の推定を可能にする、時間の割合は、細孔が融合²⁷の間、開いたままになります。

たびに実用的な、脂質および可溶性内容のラベルの両方を使用して、融合メカニズムをテストすることが重要です。例えば、脂質リリースは、このようなトンを囲むSNAREタンパク質による脂質拡散の制限として細孔ちらつき以外のプロセスによって遅らせることができました彼は細孔。この場合であれば、次に、脂質標識の放出に先行することになる内容物の放出孔可溶性プローブ​​の通過を可能にするのに十分な大きさで提供。アプローチで、より根本的な欠陥は、SBLに対する標識脂質の転送が大きく、その融合前の形状を保持している小胞にSBLを接続する狭い融合孔を介して起こることを前提である可能性があります。以前脂質放出データだけでは²⁹に基づいて提案されているようSBLへの脂質の転送はまた、SBL膜に付随するとの融合細孔の急速な拡張、SUVの非常に急速な崩壊から生じる可能性があります。両方の脂質を監視し、内容物を同時に放出し、それは多くの細孔がすべての脂質のラベルを解放した後再密封することを発見しましたが、その可溶性貨物²⁷の一部を保持しました。これは、少なくともいくつかのリポソームが融合後SBLに崩壊し、SBLへの脂質色素転写が融合孔を介して発生することはありませんことを示しています。また、LIPIDと内容のリリースでは、脂質の放出の遅延は、細孔^45を囲むSNAREタンパク質による脂質拡散の障害のために起因したこと、それはそうなって、同時に²⁷が発生しました。

可溶性コンテンツのリリースを監視しませんでしたSUV-SBL融合プロトコルは、以前Karatekinとロスマン²⁵によって出版されました。ここでは、より最近の開発は、含まれる脂質のすなわち同時モニタリング及び内容は解放し、SUV、脂質、および融合細孔特性²⁷の推定されています。プロトコルは、カバーガラス²⁵との溝を含むポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）エラストマーブロックを接合することによって作られたマイクロ流体細胞を調製するための命令で始まります。次に、脂質及びコンテンツマーカーの両方を有するV型のSUVの調製を説明します。セクション4および5は、電圧vSの導入を、マイクロ流体セルを組み立て、その場で SBLsを形成し、欠陥および流動性をチェックするための命令を提供しますフローセルと融合事象の検出にUVS。第6節は、データ分析のための手順を説明します。