מלכודת בתיווך Fusion של יחיד Proteoliposomes עם Bilayers Tethered הנתמך בתוך תא זרימת Microfluidic מנוטר על ידי Polarized TIRF מיקרוסקופי

היתוך ממברנה הוא תהליך ביולוגי אוניוורסלי הנדרש סחר תאי של שומנים וחלבונים, הפרשה, הפריה, פיתוח, ואפוף כניסת וירוס לתוך אורגניזמים מארח ^1-3. עבור רוב תגובות היתוך התאי כולל שחרור של הורמונים ומוליכים עצביים באמצעות exocytosis, האנרגיה למזג שני bilayers שומנים מסופקת על ידי היווצרות של צרור ארבעה סליל בין חלבוני הקולטן חלבון מצורף גורם מאותו המקור המסיס N-ethylmaleimide רגיש (Snare), המעוגנת שלפוחית ​​(v-Snare) ואת קרום היעד (t-Snare) ^4, בהתאמה. Exocytosis שלפוחית ​​סינפטית הוא תגובת ההיתוך המוסדרת ההדוק ביותר והוא מתרחש בתוך אלפית שני לאחר הגעתו של ^1,4,5 פוטנציאל פעולה. נקבובי ההיתוך, הקשר הראשוני בין שני תאי פיוזינג, יכול להבהב פתוח וסגורים מספר פעמים לפני resealing או להרחיב באופן בלתי הפיך ^5-7. התוצאות לשעברב חולף, "לנשק & לרוץ" היתוך, בעוד המוביל האחרון היתוך מלא. גורמים הקובעים את האיזון בין שני מצבים אלה של היתוך ומנגנוני ויסות מהבהב נקבובי אינם מובנים היטב ^5,8.

חלבוני מלכודת נדרשים עבור exocytosis; איחוי שלפוחית ​​סינפטית הוא בוטל על המחשוף של מלכודות ידי neurotoxins ^9. ניסויי היתוך גורפים באמצעות שלפוחית ​​unilamellar קטן (רכבי שטח) הראו כי מלכודות אינן נדרשות רק, אלא גם מספיק לנהוג היתוך קרום ^10. ב assay בתפזורת זו, רכבי השטח מחדש עם v-מלכודות (נ-SUV) היו מסוממים עם פוספוליפידים ניאון (N – (7-ניטרו-2-1,3-benzoxadiazol-4-י.ל.) -phosphoethanolamine (NBD-PE) ו ( N -. (lissamine rhodamine B sulfonyl) -phosphoethanolamine (LR-PE) ומעורבבים עם שלפוחית ​​ללא תווית המכילה t-מלכודות (t-SUV) בתחילה את הקרינה של-PE NBD ב-ורכבי שטח נ הוא הרווה ידי תהודה פורסטר אנרגיה העברה (סריג ) כדי LR-PE. כמו במעבדהeled נ-ורכבי שטח פתיל עם t-ורכבי שטח ללא תווית, צפיפות שטח fluorophore בקרום בשילוב עכשיו מצטמצמת ואת הגידול וכתוצאה מכך קרינת NBD-PE מדווח על היקף שומני ערבוב ^10. כמו assay בתפזורת קל להגדיר ולנתח, זה כבר נעשה שימוש נרחב כדי לחקור מנגנונים של היתוך בתיווך מלכודת ^10-14. עם זאת, יש מספר מגבלות, כגון רגישות נמוכה ורזולוצית זמן עניה. והכי חשוב, כמו מדידת הרכב, זה ממוצעי תוצאות לאורך כל האירועים עושים אפליה בין העגינה ואיחוי, כמו גם זיהוי של חומרי ביניים hemifusion קשים.

במהלך עשור הקבוצות כמה בעבר, כוללים שלנו, פתח מבחנים חדשים לפקח אירועי היתוך ברמת שלפוחית ​​יחיד ^15-27. Ha ועמיתיו השתמשו-ורכבי שטח נ קשורים על גבי משטח ומפוקחי ההיתוך שלהם עם ^18,19 t-ורכבי שטח חינם. ערבוב ליפידים היה פיקוח באמצעות סריג בין זוג fluorophores הנכנס השומנים emמיטות ב V- ו-ורכבי שטח t, בהתאמה, באמצעות קרינת השתקפות פנימית מוחלטת (TIRF) מיקרוסקופיה ^18. מאוחר יותר, המעבדה של Brunger השתמשה מיני שומני תווית אחת יחד עם סמן תוכן עבור זיהוי סימולטני של שומנים ותכני ערבוב ^20,28. הן השומנים ואת סמני תוכן נכללו בריכוזים גבוהים, מרווה עצמית; פיוז'ן עם רכבי שטח ללא תווית הביא קרינת dequenching ^20,28.

לאחרים יש התמזגו נ-רכבי השטח כדי bilayers מישוריים מחדש עם t-מלכודות ^{15-17,21-27,29.} הגיאומטריה מישוריים של היעד (t-Snare המכיל) bilayer מחק טוב יותר את תהליך ההיתוך הפיזיולוגי של קטנה, שלפוחית ​​מעוקלת מאוד עם קרום פלזמה שטוח. קבוצת סטיינם מועסקת ממברנות-פורש נקבובי מחדש עם t-מלכודות, תלוי מעל מצע סיליקון ניטריד נקבובי זוהתה היתוך עם רכבי שטח פרט נ באמצעות מיקרוסקופ סריקת ליזר confocal ^23. אחרים ונ-ורכבי שטח משומש bilayers מישוריים מחדש עם t-מלכודות, נתמך על מצע זכוכית ^{15-17,21,22,24-27,29.} היתרון הגדול של שימוש bilayers נתמך (SBLs) היא כי מיקרוסקופיה TIRF יכול לשמש כדי לזהות אירועים עגינה ואיחוי עם מעולה יחס אות לרעש וללא הפרעה מצד-ורכבי שטח נ בחינם, אם כי באמצעות מיקרופלואידיקה גם מספקת רזולוציה של אירוע יחיד באמצעות שדה רחוק תקן מיקרוסקופיה epifluorescence ^24.

אחת הבעיות המרכזיות היא האם וכיצד אינטראקציות bilayer המצע משפיע נתמך איכות bilayer ותהליך היתוך. עבודה מוקדמת עשתה שימוש SBLs מישוריים שנתמכו ישירות על מצע זכוכית או קוורץ ^15-17. SBLs אלה נעשו על ידי ספיחה, מתפרצת, מתפשטת ואיחוי של ממברנות t-SUV על פני המצע. זה מומש בקרוב, עם זאת, כי השמטת מרכיב t-Snare מפתח, SNAP25, מן SBLs ערוכים באופן זה הביא indistinguis קינטיקה עגינה ואיחוי נ-SUVדבר אליה מאלה שמתקבלות באמצעות t-מהלכודות ¹⁷ המלאות. בגלל SNAP25 דרוש לחלוטין עבור היתוך in vivo ^30,31, הרלוונטיות הפיזיולוגית של ניסיונות המוקדמים ההם הועמדה בסימן השאלה. קבוצתו של תם התגבר על אתגר זה באמצעות היווצרות bilayer מבוקרת נתמך טוב יותר ^21. זה היה אמור בתצהיר לאנגמיור-Blodgett עבור הכרוז הראשון ללא חלבון של SBL, ואחריו היתוך של monolayer כי עם t-ורכבי שטח ^21. זה הביא היתוך SNAP25 התלוי.

כדי למנוע חפצים פוטנציאליים הקשורים עם bilayer הנתמך ישירות על מצע זכוכית ללא צורך להשתמש בשיטות לאנגמיור-Blodgett, Karatekin et al. הציג פולים רך, התייבשות (אתילן גליקול) (PEG) כרית בין bilayer ואת המצע ^24. שינוי זה נבע גם היתוך SNAP25 תלוי ^24. Bilayers מרופד על שכבת פולימר רכה היה ידוע לשמר הטרנסממברני טובניידות החלבון ותפקודו ^32, וכבר נעשה שימוש במחקרים היתוך עם וירוסים ^33. בנוסף, bilayers PEGylated נראה לשמור על כמה יכולת לריפוי עצמי והם מאוד חזקים ^34,35. ראשית, שבריר זמין מסחרי, שרשרות PEG צמודי שומנים כלולים בקרום t-SUV. כאשר t-ורכבי שטח אלה פרצו ויוצרים bilayer מישוריים על מצע זכוכית, מברשת PEG מכסה גם עלונים של bilayer מישוריים. בגלל היווצרות bilayer מישוריים הוא מונע על ידי הדבקה של רשתות PEG שמסביב t-ורכבי שטח על גבי משטח הזכוכית הידרופילי, התפוצצות ליפוזום והיווצרות bilayer מישוריים אינם רגישים יחסית להרכב השומנים בשימוש. עם זאת, כאשר כמויות גדולות של כולסטרול כלולים, הגדלת הנכסים המלוכדים של רכבי השטח, רכבי השטח לא יכול להתפוצץ באופן ספונטני. אם זה מקרה, יוני הלם או divalent האוסמוטי יכולים להיות מועסקים על מנת לעזור היווצרות bilayer מישוריים ^25.

כאמור, ב ap זהproach מברשת PEG מכסה משני צידי מישוריים, נתמך bilayer. המברשת מול ערוץ הזרימה microfluidic מסייעת במניעת הידבקות ספציפית של רכבי שטח נ נכנסים אשר מכוסים גם בדרך כלל בשכבת PEG. כינונה של מתחמי V- וטי-Snare מתחיל מן הקרום-דיסטלי N-טרמיני תמורה בשלבים לעבר תחומי הפרוקסימלי קרום ^36. עבור-ורכבי שטח נ לקיים אינטראקציה עם t-SBL, את V- וטי-המלכודת N-Termini הצורך כדי לבלוט מעל מברשות PEG, אשר נראה כי המקרה בתנאים של assay. גובה מברשת ניתן להתאימו לחקר חלבונים אחרים מאשר מלכודות על ידי שינוי הצפיפות של שומני PEGylated ואת אורך שרשרת PEG ^37,38. יתרון נוסף של מברשות PEG כיסוי המשטחים הפרוקסימלי של bilayers פיוזינג הוא שהם לחקות את הסביבה הצפופה של ממברנות ביולוגיות אשר עמוסות 30,000-40,000 חלבונים בממברנה נפרדים לכל מ"ר מיקרון ^39. בדיוק כמו שרשראות PEG ב assay זה, repuשכבת חלבון lsive כיסוי ממברנות ביולוגיות צריכה להידחף הצידה כדי לאפשר קשר בין שני bilayers פוספוליפידים להיתוך להתרחש.

ערוצי זרימה microfluidic משמשים assay זה, כפי שהם מציעים יתרונות ייחודיים. ראשית, זרימת microfluidic מאפשרת בתצהיר אחיד יותר של רכבי שטח t להתפשט פתיל כדי ליצור את חולצת SBL. שנית, היקף הערוץ הקטן (<1 μl) ממזער צריכת מדגם. שלישית, בנפחים הקטנים נדרשים לאפשר הניסוי כולו להתנהל תחת זרם בלתי פוסק. תזרים מסיר חלש, יש להניח שאינו ספציפי,-ורכבי שטח נ דבקו מן SBL ^16. זה גם שומר צפיפות קבועה של רכבי שטח v מעל חולצת SBL, לפשט ניתוח הקינטית ^17. לבסוף, שלפוחית ​​עגנה נבדלת בקלות מאלו חינם נישאו על ידי הזרימה ^25. ניתן להשתמש הרביעית, כמה ערוצים microfluidic באותו coverslip, כל חיטוט מצב שונה. זה מאפשר השוואה של דורות תנאיםng בטווח ניסיוני אותו. גישה דומה נוצל בעבר על ידי קבוצת ואן Oijen ללמוד היתוך בין וירוס שפעת SBLs מרופד ^33.

במיקרוסקופיה TIRF, את הדעיכה מעריכית של שדה החלוף (עם קבוע דעיכה ~ 100 ננומטר) עירור קרינת גבולות למולקולות אלה נמצאים בסמיכות קרובות מאוד של הממשק-חיץ זכוכית. זה ממזער תרומה של מולקולות ניאון כי הם מרוחקים יותר, מגדיל את יחס אות לרעש, ומאפשר רגישות מולקולה בודדת עם זמני חשיפת מסגרת של 10-40 אלפיות שני. השדה חלוף גם מוביל לעליית אות על היתוך: כמו העברת השומנים שכותרתו מתוך הרכב לתוך SBL, הם מוצאים את עצמם, בממוצע, בשדה עירור חזק. עלייה זו הקרינה חזקה עבור ליפוזומים גדול.

אם אור המקוטב משמש להפקה בתחום החלוף, אפקטים נוספים לתרום לשינויי קרינה על transfer תוויות מתוך הרכב לתוך SBL. יש צבעי שומנים מסוימים כוללות דיפול המעבר בכיוון עם זווית העדיפה ממוצע ביחס bilayer שבה הם משובצים. זה יוצר הבדל בסך של הקרינה הנפלטת fluorophores כשהם נמצאים SUV מול SBL, מאז הקורה המקוטב שילהיב צבעים בשתי ממברנות שונות. לקבלה לשעבר, קורה העירור יהיה אינטראקציה עם הדיפולים מעבר אורינטציה ברחבי SUV הכדורי, ואילו האחרון, אורינטציות דיפול תהיינה מוגבלות על ידי גיאומטרית SBL השטוחה. לדוגמה, כאשר s-מקוטב לאור האירוע (מקוטב נורמלי אל מישור הפגיעה) משמש, עירור יעיל יותר כאשר צבען הוא SBL מאשר את המכונית בשביל מקביל אוריינטציה דיפול המעבר השומנים לצבוע קרום ^29,40 (כמו זה של DiI או עשה ^41-43). רכב שטח מסומם עם fluorophore כזה מופיע לעמעם כשזה רציפים על SBL (איור 7, Representat ive תוצאות). כתוצאה נקבובי היתוך פותח ומחבר את ממברנות SUV ו SBL, בדיקות ניאון מפוזר לתוך SBL ולהיות יותר סיכוי להיות נרגש שדה החלוף המקוטב של ^25,27,29. כתוצאה מכך, אות הקרינה שולב סביב אתר ההיתוך מגבירה בחדות במהלך העברה לצבוע מתוך הרכב לתוך ²⁷ SBL (איור 3 ו האיור 7). גורם נוסף שתורם לאותת שינויים נלווים היתוך dequenching של תוויות ניאון כפי שהם המדולל כאשר הועברו אל SBL. תרומת dequenching היא בדרך כלל מינורי לעומת תופעות ריקבון קיטוב שדה חלוף ב assay המתואר כאן, כי רק חלק קטן ( ) של השומנים מסומנים.

גידול האות על היתוך ניתן לנצל כדי להסיק נכסים נקבוביים היתוך ידי השוואה בין הזמן,1 "src =" / files / ftp_upload / 54,349 / 54349eq2.jpg "/>, הנדרשת עבור השומנים לברוח דרך נקבוביות כי הוא חדיר בחופשיות שומנים לזמן השחרור בפועל, . אם שני סולמות הזמן ניתנים להשוואה, זה היה להסיק כי נקבובי מציג התנגדות מעט זרימת שומנים. עם זאת, אם זמן השחרור בפועל הוא משמעותי יותר מאשר הזמן לשחרור דיפוזיה-מוגבל, זה היה להצביע על תהליך, כגון הבהוב נקבובי, מעכבי שחרור שומנים. שעת השחרור מוגבל דיפוזיה, , תלוי בגודל של liposome פיוזינג ו-diffusivity השומנים; להערכתה דורשת שני פרמטרים אלה כדי לכמת. רגישות המולקולה הבודדה של assay מאפשרת diffusivity שומנים כדי להימדד על ידי מעקב אחר כמה fluorophores שומנים יחידים לאחר שחרורם לתוך SBL לכל אירוע היתוך ^26. גודלו של כל שלפוחית ​​פיוזינגניתן לאמוד ²⁷ על ידי שילוב (i) את עוצמת צבע שומנים יחיד, (ii) שינוי הקרינה הכוללת סביב אתר עגינה אחרי הכל fluorophores מועבר לתוך SBL על היתוך, (iii) צפיפות התיוג הידועה של SUV שומנים, וכן (iv) באזור לכל שומנים. עבור אירועי היתוך רבים, פעמי שחרור שומנים בפועל נמצאו הרבה איטי מצפוי על ידי שחרור מבוקר דיפוזיה ^27, כפי שצוינו בהנחת גודל SUV האחיד בעבר ^44. בהנחת פיגור של שחרור שומנים נובע הנקבוביות הבהובים, מודל כמוני מאפשר אמיד של "פתיחות נקבובית", את החלק היחסי של זמן הנקבובי נשאר פתוח במהלך ההיתוך ^27.

בכל פעם מעשית, חשוב לבחון מנגנוני היתוך באמצעות שני שומנים ותוויות תוכן מסיסים. לדוגמא, הודעת שומנים יכולה להיות מפגר ידי תהליכים אחרים מאשר מהבהב נקבובי, כגון הגבלת דיפוזיה שומנים ידי חלבוני המלכודת מקיף tהוא נקבובי. אם זה היה המקרה, ולאחר מכן שחרר תוכן שתקדים שחרור תוויות שומנים, ספק את הנקבוביות הן גדולות מספיק כדי לאפשר מעבר של בדיקות מסיסות. פגם מהותי יותר בגישה יכול להיות ההנחה כי העברת שומנים שכותרתו אל SBL מתרחשת הדרך נקבובית היתוך צר המחבר את SBL על שלפוחית ​​כי שמרה צורה מראש ההיתוך שלה במידה רבה. העברת ליפידים לתוך SBL יכולה גם לנבוע התרחבות מהירה של הנקבובית ההיתוך עם תכונת לוואי, הקריסה מהירה מאוד של SUV לתוך קרום SBL, כמו בעבר מוצע מבוססת על נתוני שחרור שומנים לבד ^29. ניטור הוא השומנים ותכנים לשחרר בו זמנית, נמצא כי נקבוביים רבים חזרו וחתום לאחר שחרור כל תוויות השומנים שלהם, אבל שמור על כמה המטענים המסיסים שלהם ^27. זה מצביע על כך לפחות ליפוזומים כמה לא לקרוס לתוך SBL לאחר היתוך, וכי העביר לצבוע שומנים לתוך SBL מתרחש דרך נקבובית היתוך. בנוסף, lשחרור ipid ותכנים התרחשו בעת ובעונה אחת ^27, ולכן קטן הסיכוי כי פיגור של שחרור השומנים נבע מעצור של דיפוזיה השומנים ידי חלבונים המלכודת סביב הנקבובית ^45.

פרוטוקול היתוך SUV-SBL כי לא פקח על שחרור תוכן מסיס פורסם בעבר על ידי Karatekin ורוטמן ^25. הנה, ההתפתחויות אחרונות יותר כלולות, כלומר ניטור סימולטני של שומנים ותכנים לשחרר ואמידה של SUV, שומנים בדם, ומאפיינים נקבוביים היתוך ^27. פרוטוקול מתחיל עם הוראות להכנת תאים microfluidic, שנעשו על ידי מליטה פולי (siloxane דימתיל) (PDMS) אלסטומר המכיל לחסום חריצים עם coverslip זכוכית ^25. לאחר מכן, הכנה-ורכבי שטח נ עם שומנים הם וסמני תוכן מוסברת. סעיפים 4 ו -5 לספק הוראות להרכבת תאים microfluidic, להרכיב את SBLs באתרו ובדיקת ליקויים ונזילות, כניסתה של VSיובס לתוך תאי הזרימה וזיהוי של אירועי היתוך. סעיף 6 מספק הוראות לניתוח נתונים.