Summary

חלון ירך דגם קאמרי<em> In vivo</em> מעקב תא Murine מח עצם

Published: July 28, 2016
doi:

Summary

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Abstract

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Introduction

מוח עצם הוא איבר חשוב המעורב hematopoiesis ורגולציה חיסונית. הוא מורכב מרכיב hematopoietic המכיל תאי גזע אבות היווצרות דם (HSPCs), ומרכיב סטרומה המכיל ובתאים הלא hematopoietic כי להצמיח תאי mesenchymal 1. שני שלישים של פעילות hematopoietic מוקדש לדור של תאים מיאלואידית 2. בפרט, מספר רב של נויטרופילים מיוצר במח העצם, עם 1-2 x 10 11 תאים שנוצרו ליום בתוך אדם מבוגר נורמלי 2. נויטרופילים הם קו ההגנה הראשון מפני זיהומים מיקרוביאליים שמורות בעיקר במח העצם עד מתח מפעילה התגייסותם להשלים נויטרופילים היקפי 1,3. בנוסף להשפעות שלהם אנטי מיקרוביאליים, מחקרים אחרונים מראים תפקיד חשוב של נויטרופילים בביולוגיה סרטן, נתקל בשני פרו פנוטיפים אנטי tumorigenic תלוי צמיחה הפיכתבטא גורם (TGF-β) איתות 4,5 microenvironment הגידול. יתר על כן, מחקרים הראו כי נויטרופילים שמצטברים גידולים ראשוניים להשפעות פרו-tumorigenic ו גרורתי ידי דיכוי הפונקציה ציטוטוקסיות של תאי T 6,7, תוך נויטרופילים במחזור להפעיל ציטוטוקסיות, אנטי-גרורתי השפעה 8. ככזה, החקירה של תאי hematopoietic במח העצם, במיוחד נויטרופילים, היא חיונית כדי הבהרת תפקידם בתקנה חיסונית גידול.

Histopathology וספירת דם היקפית מלאה משמשים באופן שיגרתי כדי להעריך שינויים הסלולר מבניים מח עצם 9. עם זאת, שיטות אלה רק לספק מידע סטטי של אוכלוסיות תאים שונות או microstructures רקמות. אורך in vivo הדמיה ניתן להשתמש בשילוב עם השיטות הסטנדרטיות כדי להעריך את הדינמיקה של מרכיבים תאיים, כלי דם ואת סטרומה מרובים וכן תא אל גאינטראקציות ell באופן אורכי. מיקרוסקופיה Intravital (IVM), מוגדר הדמיה של חיים חיים ברזולוציה מיקרוסקופית 10, הוא שימושי במיוחד להערכת תהליכים תאיים דינמיים לאורך זמן באותו המדגם, צמצום מספר בעלי חי ניסוי הנדרש. IVM היא לעתים קרובות בשילוב עם תא חלון מושתלים כרוני (WC) לגשת איבר עניין הדמיה במשך זמן של שבועות עד חודשים. מודלי WC גולגולתי ו-skinfold הגבו יש את ההיסטוריה הארוכה ביותר של שימוש שראשיתה אמצע 1990. לאחרונה, מודלים WC איבר ספציפי אחרים כגון אלה של כרית שומן החלב ואת אברי הבטן השונים פותחו 11.

הגישה הטיפוסית הדמית מח עצם in vivo יש בעיקר מעורבת חשיפת מִכסֵה הַגוּלגוֹלֶת של עכברים, שם העצם הדליל מאפשר הדמיה ישירה של תאים בודדים עם התערבות כירורגית מינימאלית 12-14. עם זאת, מח עצם calvarial עשוי bדואר שונה מזו של עצמות אחרות, כגון עצם הארוך, כפי שהוכח על ידי מספר נמוך יותר של HSPCs ותאי היפוקסי ב מִכסֵה הַגוּלגוֹלֶת, מעידה מופחתת תחזוקה ופיתוח של HSPCs 15. לכן, גישות חלופיות להערכת מרכיבים תאיים ב העצם הארוך נחקרו. אלה כוללים חשיפה ישירה של מח עצם ירך 16 והשתלות אקטופי של ירך פילוג skinfold הגבה בב"ש 17. עם זאת, לשעבר הוא הליך מסוף שאינו מאפשר מעקב של שינויים הסלולר, מבניים ותפקודיים לאורך תקופות זמן ארוכות, ואת הסיכוי האחרון מפריע פונקצית מח עצם נורמלית עקב השתלת עצם הירך לאתר אקטופי בתוך WC הגבה skinfold. שיטה נוספת המאפשרת הדמיה סדרתי orthotopic של מח עצם הירך לאורך זמן הוא השימוש של WC בעצם הירך. בדוח הקודם אחת הפגינו הדמיה לטווח ארוך מיקרו מחזורי במח העצם הירך באמצעותירך WC בעכברים 18. בנוסף, החוקרים הדגימו ויזואליזציה של תאים סרטניים בעצם הירך, המציין השירות שלה גרור במח עצם ניטור. עם זאת, עיצוב בב"ש זה היה מוגבל על ידי גודל גדול שלה (בקוטר 1.2 ס"מ) ואזור הדמיה קטן יחסית (4 מ"מ קוטר), אשר היה מתאים רק עכברים גדולים (26-34 גרם, 3-6 חודשים של גיל) ובכך להפוך את להתקרב מעשי לשימוש שגרתי.

לכן, אסלה חדשה עם גודל כולל קטן ואזור הדמיה הפנימית גדול נועדו לצורך מחקר זה. מטרת המחקר הנוכחי הייתה לקבוע שיטת הדמית סוגי תאים שונים במח עצם הירך. מודל WC הירך פותח בתוך הבית ושמש לדמיין ולעקוב אחר נויטרופילים בתוך רשת כלי דם 3D. באמצעות מודל זה, IVM של מח העצם ניתן לבצע באופן סדרתי על 40 ימים. גישה זו ניתן ליישם במגוון תחומי הבהרת תהליכי hematopoiesis, תקנה חיסוניתהתפתחות גידולים nd.

Protocol

הערה: כל עבודת החיה בוצעה תחת פרוטוקול # 2615 אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים מוסדי אונ' בריאות ברשת ועדת שימוש. 1. הכנת כירורגים של עכבר לפני הניתוח, לעקר את כל מכשירי הניתוח ובית נבחרי החלון (WC…

Representative Results

מח עצם ירך Murine הוא לגשת בהצלחה באמצעות WC לאפשר ויזואליזציה של נויטרופילים פרט רשתות כלי דם. איור 1 מציג את מכשיר WC ומתאר את ההליך כירורגי, אשר כרוך בחשיפה של העצם ודילול הירך של עצם קורטיקלית כדי לקבל גישה אופטית בתוך עצם. הניתוח ונסבל היטב ע?…

Discussion

הדמיה בזמן אמת, סידורי של התהליכים התאיים הדינמיים במח עצם מספקת מידע כי הוא מאתגר אחרת להשיג באמצעות טכניקות קונבנציונליות כגון היסטולוגיה וספירת דם מוחלטת. מודל WC הירך המתואר כאן מספק הזדמנויות ייחודיות לחקור שינויים הסלולר מבניים במח העצם לאורך זמן. למרות מודל WC …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות מתקן מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת (www.aomf.ca) בבית רשת בריאות באוניברסיטת לסיוע עם מיקרוסקופיה, ומר ג'ייסון אליס מן חנות הנסיכה מרגרט Cancer Center מכונות להכנת הב"ש והשלב הדמיה. אנו רוצים גם להודות לד"ר איריס Kulbatski לעריכת כתב יד.

Materials

NRCNU-F athymic nude mice Taconic Ncr nude 8-10 weeks old, female
Saline Baxter JB1302P
Ketamine hydrochloride Bioniche Animal Health Canada, Inc.  DIN 01989529
Xylazine Bayer HealthCare, Bayer Inc. DIN 02169592
Surgical drape Proxima DYNJP2405
Electric heating pad Life Brand 57800827375
Stereomicroscope Leica Leica M60
Eye ointment (tear gel) Novartis  T296/2
7.5% betadine Purdue Frederick Co 67618-151-16
70% isopropyl alcohol GreenField P010IP7P
10% betadine Purdue Frederick Co 67618-150-05
Scalpel handle (#3) Fine Science Tools 10003-12
Scalpel blade (#15) VWR 89176-368
Spring Scissors curved Fine science Tools 15023-10
Baby-Mixter Hemostat Fine science Tools 13013-14
Fine Scissors Fine science Tools 14094-11
Extra Fine Graefe Forceps Fine science Tools 11151-10
Halsted-Mosquito Hemostats Fine science Tools 13008-12
Micro-drill Harvard Apparaus 72-6065
Micro-drill burrs Fine Science Tools 19007-14
Femur window chamber PMCC machine shop custom design 9.1mm- 8.5mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9mm (distance between two holes), 0.7mm (thickness)
U-shaped bar PMCC machine shop custom design 13.8mm (length), 1.6 mm (width), 3.7mm (height)
Coverglass (8mm) Warner Instruments  HBIO 64-0701 CS-8R
Retaining ring (8mm) ACKLANDS GRAINGER UNSPSC # 31163202
Nuts (hexagon stainless steel) Fastenal 70701
Dental cement 3M RelyX U200
Suture (5-0 Monosof black) Covioien SN-5698
Halsey needle holder Fine Science Tools 12501-13
Buprenorphine (Temgesic) Reckitt Benckiser DIN 0281251
Meloxicam (Metacam) Boehringer Ingelheim DIN 02240463
Amoxicillin (Clamavox) Pfizer DIN 02027879
FITC-Dextran Sigma-Aldrich FD2000S
APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1)  eBioscience 17-9668
Two-photon microscope LSM 710 Carl Zeiss Zeiss LSM 710 NLO
Imaging stage PMCC machine shop custom design 15.9cm (length), 11cm (width), 0,9cm (height)
Imaris software Bitplane Imaris 8.0 Image analysis software described in Section 3 of the Protocol 
Zen 2012 Zeiss Zen 2012 Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol 

References

  1. Zhao, E., et al. Bone marrow and the control of immunity. Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).
  2. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  3. Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
  4. Fridlender, Z. G., Albelda, S. M. Tumor-associated neutrophils: friend or foe?. Carcinogenesis. , (2012).
  5. Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: ‘N1’ versus ‘N2 TAN. Cancer Cell. 16 (3), 183-194 (2009).
  6. Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing [ggr][dgr] T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522 (7556), 345-348 (2015).
  7. Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nat Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
  8. Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20 (3), 300-314 (2011).
  9. Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34 (5), 548-565 (2006).
  10. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
  11. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging. IntraVital. 3 (2), e29917 (2014).
  12. Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. (96), e52476 (2015).
  13. Mazo, I. B., et al. Hematopoietic Progenitor Cell Rolling in Bone Marrow Microvessels: Parallel Contributions by Endothelial Selectins and Vascular Cell Adhesion Molecule 1. J. Exp. Med. 188 (3), 465-474 (1998).
  14. Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow. J. Vis. Exp. (91), e51683 (2014).
  15. Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells. Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).
  16. Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods Mol Biol. 750, 215-224 (2011).
  17. Balan, M., Kiefer, F. A novel model for ectopic, chronic, intravital multiphoton imaging of bone marrow vasculature and architecture in split femurs. IntraVital. 4 (2), e1066949 (2015).
  18. Hansen-Algenstaedt, N., et al. Femur window–a new approach to microcirculation of living bone in situ. J Orthop Res. 23 (5), 1073-1082 (2005).
  19. Xu, N., Lei, X., Liu, L. Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy. J. Vis. Exp. (55), e3296 (2011).
  20. Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
  21. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  22. Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
  23. Bucher, K., et al. Fluorescent Ly6G antibodies determine macrophage phagocytosis of neutrophils and alter the retrieval of neutrophils in mice. J Leukoc Biol. 98 (3), 365-372 (2015).
  24. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  25. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), (2013).
  26. Koewler, N. J., et al. Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur. J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).
  27. Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
  28. Liu, K., et al. A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system. J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).
  29. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  30. Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
  31. Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M., Singh, S. R., Coppola, V. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. 1194, 289-312 (2014).

Play Video

Cite This Article
Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow. J. Vis. Exp. (113), e54205, doi:10.3791/54205 (2016).

View Video