Выделение и расширения мезенхимальных стволовых / стромальные клетки, полученные из плаценты человека ткани

Исследовательские комитеты человека по этике в Mater служб здравоохранения, Royal Brisbane и женской больницы, Технологический университет Квинсленда и Университета Квинсленда одобрил исследование и сбор образцов плаценты человека, используемых в исследовании. Все протоколы выполнены с национальными руководящими принципами исследований. Пациенты при условии, что письменное информированное согласие на использование тканей для исследовательских целей. Третий триместр плацента были получены от здоровых матерей следующих обычных кесарева сечения (КС) родов на срок от вышеупомянутых больниц в Брисбене, Австралия. Мужской дискордантные беременностей для срочных образцов были использованы в этом исследовании, чтобы отличить фетальной от материнских клеток. Фетальный пол был определен с помощью ультразвука до рождения и / или визуальный осмотр новорожденному при рождении медицинским персоналом. X и Y – хромосома флуоресценции в гибридизация (FISH) в была использована для дальнейшей проверки и пол плода или материнского происхождения ткани , спасенный оторигинальные плацента. 1. Перед жатвы, подготовить следующие Примечание: При составлении ферментные решения, специфические требования и концентрации, предусмотренные заводом-изготовителем для каждого продукта должны быть соблюдены. Ферменты часто предоставляется в виде сырой смеси белков, поэтому подобные ферменты из различных компаний, вероятно, имеют различные виды деятельности / концентрации. По этой причине рекомендации изготовителя должны быть признаны и приготовления раствора, возможно, придется изменить соответствующим образом. Подготовка или приобрести от 1,5 до 2 л общего стерильными Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) для этого протокола. Приготовьте коллагеназы I маточного раствора путем взвешивания коллагеназы типа I и растворить 1 мг / мл в HBSS и водоворот осторожно, чтобы обеспечить полное растворение. Определить объем HBSS (содержащих кальций и магний), необходимые для приведения раствора коллагеназы до 100 единиц (U) / мкл (1,000x маточный раствор), а затем фильтруют с использованием 0,2 &# 181; м шприц фильтр. Алиготе объем 1 мл в 1,5 мл пробирки и хранят при -20 ° С до тех пор, пока это необходимо. Подготовка диспаза маточного раствора путем растворения нестерильный диспазу при 10 мг / мл в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS) без кальция или магния. Далее разбавить ДЗФР без кальция или магния до конечной концентрации 2,4 ед / мл. Фильтр стерилизовать через шприцевой фильтр 0,2 мкм. Алиготе объем 1 мл в 1,5 мл пробирки и хранят при -20 ° С до тех пор, пока это необходимо. Готовят дизоксирибонуклеаза (ДНКазы) -I маточного раствора путем растворения ДНКазы I в дозе 10 мг / мл в 0,15 М NaCl. Фильтр Копание шприцевой фильтр 0,2 мкм. Алиготе объем 1 мл в 1,5 мл пробирки и хранят при -20 ° С до тех пор, пока это необходимо. Подготовка рабочего раствора переваривания путем объединения 100 ед / мл коллагеназы типа I, В.5 мкг / мл ДНКазы I и 2,4 Ед / мл диспаза в свободной от сыворотки DMEM. Свежеиспеченный разморозить и разбавьте запасов фермента непосредственно перед использованием. Примерно, в соотношении 1: 1 пищеварения раствораобъем до нужного объема ткани требуется (например , 10 мл ткани, измеренная в 50 мл трубки, требуется 10 мл раствора пищеварения). Готовят раствор 4% параформальдегида (PFA) в PBS и доведения рН до 7,4 15. Хранить в 25 мл аликвот при -20 ° С в течение длительного времени или при 4 ° С в течение 1 недели. Приготовьте MSC из культуральной среды DMEM-низкого уровня глюкозы (DMEM-LG), дополненной 1x антибактериальной и противогрибковой раствора и 10% нетепловыделяющих инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки. MSC-класса FBS можно приобрести у многих поставщиков FBS. Автоклав стерилизовать рассечение оборудование заранее в соответствии с ведомственным руководящим принципам. К ним относятся ножницы, пинцеты, скальпели и большой металлический поднос рассечение. Сбор дополнительной стерильной культуре ткани из пластмассы и расходные материалы (например , лезвия скальпеля, 50 мл и 15 мл пробирки, 25 мл, 10 мл и 5 мл пипетки, а 75 или 175 см 2 клеточной культуры баллонах). Использование стандартной первичной культуры клеток лабораторное оборудование: класс II Biosafety шкаф подходит для изоляции первичных клеток, клеточных культур инкубатор при 5% CO 2 и 37 ° С, коромысло в 37 ° С инкубатор и центрифугу, вместимостью 50 мл пробирки. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты: лабораторный пальто, 2 пары перчаток (во все времена), защитные очки и близко носком обуви в соответствии с ведомственным руководящим принципам. Подготовить соответствующие дезактивирующих растворов для образцов крови человека в соответствии с ведомственным руководящим принципам и жидких биологических отходов контейнеров заранее. 2. Выделение плацентарный MSC Получение плаценте Платье в необходимых средств индивидуальной защиты. Настройка биологической безопасности с необходимыми материалами, растворов и контейнеров для отходов, чтобы выполнить процедуру до ферментативного расщепления (раздел 2.5.6). Получить плаценту с информированного согласия и этического утверждения. Собрать плаценту через кесарево секции в асептических хирургических условиях, а также упаковка в стерильный пакет или ведро для транспортировки в лабораторию. Во время транспортировки и перед вскрытием, хранить плаценту при комнатной температуре или температуре 4 ° С. Примечание: Ткань можно хранить в течение до 6 часов без снижения производительности для культивирования клеток. Ограничение времени между сбором плацента и обработки ткани, где это возможно. Эта рекомендация основана на практических вопросах. В некоторых случаях, мы затянули процесс выделения клеток до 6 часов после рождения. В этих случаях плацента содержались при комнатной температуре или при температуре 4 ° С (в лаборатории или в центре сбора). Не было обнаружено различий обнаруживаемые, приведенной выше общей вариации донора, в MSC, полученного из последов, когда они хранились при 4 ° С или при комнатной температуре. Поместите контейнер с плацентой в кабинете биологической безопасности. Откройте контейнер и передать через плаценту в стерильный лоток. Открыть из фетальные мембраны (амниотической или амнион-хорионический laeve) 8. Стать сориентирована частями плаценты. Фетальный сторона имеет вставку пуповины, которая в общем случае, центрально вставляется в плаценте. Материнской линии (облицованы децидуальной базального), которое противоположно фетальной стороны, имеет очевидные семядоли (или долей). Чтобы начать препарирование, сориентировать плаценту с пуповиной вверх в стерильный лоток. Примечание: Этот протокол предназначен для получения достаточное количество клеток семени в одну колбу Т175 от каждого из трех типов тканей. Каждый Digest начинается с приблизительно 10 г ткани. Это аналогично Отправной количество колб как MSC культур, инициированных из аспирата 20 мл костного мозга. Если все большее число клеток желательно, то большее количество тканей может быть собран и протокол можно масштабировать линейно. Размеры ткани, подлежащей заготовленные являются лишь ориентировочными, что является практичным с плацентарной ткани. Есть несколько defininг особенности в плацентарных ворсинок, которые могут быть использованы в качестве опорной точки. Указанные размеры служат в качестве оценки и пуповина используется в качестве ориентира на поверхности плода. Рассечение (D) тканей децидуальной Флип плаценту над тем, материнская поверхность (децидуальной базального) вверх. Убедитесь, что сторона плода с пупочной точки вставки шнура лицевой стороной вниз. Вырезать куски толщиной 0,5 см с материнской стороны плаценты (содержащий децидуальная базального ткани). Поместите тканевые части в чашку Петри, содержащую HBSS во время вскрытия, чтобы держать куски ткани увлажненной. Перенести достаточную ткань, чтобы заполнить трубки до отметки 10 мл в 50 мл пробирку (это примерно 10 г ткани). Рассечение плиты хорионического (CP) Ткань Механически удалить амниотической мембраны из плода поверхности плаценты (не амниотической), оставляя чоrionic frondosum (хорионический пластины) нетронутыми. Вырезать куски ~ шириной 1 см на 0,5 см глубиной от хорионического пластины. Урожай хорионический пластины из области, ближайшей к пуповине, подальше от края плаценты. Поместите кусочки ткани в чашку Петри, содержащую HBSS во время диссекции, чтобы держать их увлажненной. Перенести достаточную ткань, чтобы заполнить 50 мл пробирку до 10 мл отметки (~ 10 г ткани). Рассечение ворсин хориона (CV) Ткань Рассеките CV ткани ~~~HEAD=iobj 1 см 2 х 0,5-1 см в глубину от плацентарной ткани , где уже была удалена CP. Опять же, урожай резюме из региона ближе всего к пуповине, от края плаценты. Постарайтесь оставаться на расстоянии не менее 1 см от материнской стороны плаценты (содержащей децидуальной базального ткани); цель состоит в том, чтобы собрать ткань от внутренней части плацентарной ткани ворсинки. Поместите кусочки ткани в чашку Петри, содержащую HBSS в течение Диссефикция, чтобы держать их увлажненной. Перенести достаточную ткань, чтобы заполнить 50 мл пробирку до 10 мл отметки (~ 10 г ткани). Мясорубки и ферментативные Расщепление D, CP и CV плацентарные Тканей Поскольку существует ~ 10 г D, CP или CV ткани в трех различных 50-мл пробирки, заполнить каждую пробирку с примерно 40 мл HBSS и повторно инвертировать трубку для того, чтобы вымыть ткани (повторить в течение ~ 10 сек). Слейте супернатант и повторить этот шаг мыть 2-3 раза до тех пор, пока раствор не станет в значительной степени свободна от крови. С помощью 10 мл пипетки или длинный пинцет, чтобы гарантировать, кусочки ткани не теряется из трубки (ы), когда декантированием супернатанта. Возвращение кусочки ткани на 10 см чашку Петри с минимальной передачей жидкости. Чоп / фарша ткань на мелкие кусочки примерно 1-5 мм 3 с ножницами или лезвием бритвы. Передача рубленые ткани обратно в соответствующей маркировкой (D, CP или CV) 50 мл пробирки. Добавить свеже ДГОред дайджест СМИ по меньшей мере , соотношении 1: 1 с тканью (например , 10 мл ткани плюс 10 мл переваривать средств массовой информации). Заменить колпачок на каждой трубе и инвертировать трубок несколько раз перемешать. Инкубируйте ткани в пробирки с переваривать СМИ в течение 1-2 часов при температуре 37 ° С. Увлажненной атмосфере 5% CO 2 не являются необходимыми для этого шага. Примечание: Быстрое встряхивание требуется для того, чтобы эффективно диссоциируют клеток из ткани и максимальный выход MSC. Ограниченный выход будет очевидно, очень немногие клеток, прикрепленных к колбе культуры на 48 ч и времени первого прохождения более чем через 1-2 недели. Время инкубации и метод встряхивания зависит от 37 ° С инкубатор доступны в лаборатории, так и может потребовать оптимизации. Для инкубатора с быстрым и управляемым механизмом встряхивания, место ткани и переваривать среду в 50 мл пробирку или стерильного коническую колбу, место в инкубаторе и установить встряхивая скорость до 250 оборотов в минуту. Это приведет к полному дайджестаткань в течение 1 ч. В качестве альтернативы для инкубатора с мягким покачиванием или нет раскачивания механизма, вручную трясти трубку быстро и энергично вручную в течение 10 с каждые 30 мин в течение от 1,5 до 2 часов. Период инкубации фермента является подходящее время, чтобы отказаться от отходов, очистки шкафа биобезопасности ненужных предметов, изменить лабораторный халат, если загрязнен и подготовиться к следующей части процедуры. Коллекция мононуклеаров и Покрытие в колбах Примечание: Из предыдущего шага, три 50 мл пробирки (D, CP или CV) с перевариванием Куски ткани. Когда ткань раствор дайджеста развивается мутный внешний вид и белые кровеносные сосуды очевидны в ткани, пищеварение завершена. Добавить 30 мл среды, содержащей MSC FBS в каждую пробирку, чтобы инактивировать ферменты, содержащиеся в растворе пищеварения. Для того, чтобы отделить мононуклеарных клеток из большого непереваренной мусора, пульс центрифугировать 50 мл трубки. В кратком изложении, позволяютцентрифуга достичь 340 х г в течение 5 сек, а затем остановится. Это заставит крупного мусора, чтобы осадить в нижней части трубки, оставляя мононуклеарных клеток в жидкой суспензии. Примечание: одноядерные клетки будут оставаться в жидкой фазе, если трубка находится только на короткое время (импульсный) центрифугируют. Если центрифугирование удлиняется, мононуклеарные клетки будут также осадить на дне пробирки с кусочками ткани, что приводит к нежелательной потере клеток. Собирают супернатант, содержащий мононуклеарные клетки, и передать это в новый 50 мл пробирку с пипеткой. Добавьте 30 мл среды или HBSS к оставшемуся мусора плацентарной ткани и энергично встряхивают. Это приведет оставшиеся отдельные одноядерные клетки в суспензии и дать второй урожай мнимого MSC из ткани. Пульс центрифугу трубку во второй раз, и снова передать супернатант в новую 50 мл трубки. Повторите этот шаг в третий раз, чтобы максимально увеличить эффективность сборамононуклеарных клеток из каждого источника ткани. Объединяют супернатанты от каждого из отдельных типов тканей в две 50 мл пробирки. Это даст 6 трубок (всего 2 трубы каждого D, CP и CV). Центрифуга каждая трубка в течение 5 мин при 340 х г. Этот этап будет осадить мононуклеарных клеток в нижней части труб. Тщательно сцедить или пипеткой надосадочную в отходы. Нет необходимости, чтобы попытаться устранить каждую каплю надосадочной жидкости. Примечание: Клеточный осадок будет хрупкой из-за большого количества красных кровяных телец. Будьте осторожны, чтобы случайно не выбросить осадок, если вы сцеживания непосредственно из 50 мл трубки. После удаления большей части супернатанта, осторожно вылить трубку несколько раз пальцем, чтобы смещать осадок клеток. Объединяют гранул, так что есть одна труба для каждого D, CP или CV ткани и ресуспендируют каждый в 35 мл MSC средств массовой информации. Дополнительно: Фильтр мононуклеарную фракцию через сетчатый клеточный фильтр 100 мкм положим ир в 50 мл пробирку, чтобы удалить сгустки клеток или волокнистого материала. Примечание: Уход требуется, поскольку фильтры могут легко засорить и переполнять. Кроме того, воздушные пузырьки могут препятствовать фильтры сливать. Если это происходит, медленно поднимите фильтр из трубы, чтобы позволить воздуху проходить под фильтром, промыть фильтр через с среды для культивирования клеток или обмен на новый фильтр. За исключением этапе фильтрации не появляется, чтобы изменить выход или качество последующих культур MSC. Необязательно, эритроцит (RBC) лизис или центрифугирования в градиенте плотности могут быть выполнены на этой стадии 15. Тем не менее, наш опыт показывает, что РБК не мешают с приложением MSC или пролиферации, и поэтому РБК лизиса не является необходимым. Мононуклеары можно было бы рассчитывать на данном этапе , если удаление эритроцитов было проведено 15. Несмотря на то, что подавляющее большинство клеток на этой стадии не будет ЦКМ, но быть эмбриональных происхождения трофобласта, эндотелиальные клетки и гемопоэтические клетки, а также мавнешнее происхождение кроветворные клетки и децидуальной клетки стромы. Передачи клеточной суспензии для каждого из D, CP или CV ткани в одну колбу T175 и культуры в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2. Сообщение Изоляция-элементный расширения По прошествии 48 часов после первоначального выделения, удалите среду из каждой из колб (D, CP и CV) и заменить 35 мл свежей MSC сред. Отработанный среда и отдельные клетки могут быть отброшены, а мнимый ЦКМ , как предполагается, быть присоединены к культуре ткани колбы 16. Возвращение колб в инкубатор еще в течение 24 ч. После дополнительных 24 ч культуры, моют колб дважды с ДЗФР (25 мл), чтобы удалить твердые частицы и эритроциты. Вихревой жидкости вокруг дна колбы, чтобы сместить RBCs. С помощью пипетки, чтобы удалить жидкость и твердые частицы. Добавить 35 мл MSC средств массовой информации в колбах и вернуть колб в инкубатор. Заменить носитель два раза в неделю, а вcubate культуры до клеточных монослоев 80- 90% сплошности. Это начальное расширение занимает 4-14 дней, в зависимости от качества ткани, количество исходного материала и эффективности и времени инкубации с раствором дайджеста. 3. Субкультура ЧВОФ Когда культуры 80-90% сплошности, мыть два раза с 20 мл 1x HBSS или ДЗФР и выбросьте стирок. Добавить трипсин-заменителя в каждую колбу (т.е. используют 5 мл для T175 колбы). Инкубацию колб в течение 5 мин при 37 ° С, чтобы освободить MSC от поверхности тканевой культуры. Нажмите по бокам колбы каждые ~ 2 мин для облегчения отделения. Когда клетки отделяют от поверхности и в суспензии отдельных клеток, промыть клетки из колбы MSC медиа и сбора клеток в пробирках. ЦКМ СМИ будет разбавлять и деактивировать трипсин-заменитель (использование ~ 15 мл MSC среды на T175 колбу). Перенести содержимое каждой тканевой культуральной колбы до 50мл трубки. Центрифуга трубки при 340 мкг в течение 5 мин для осаждения клеток. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют клеточный осадок в 1 мл MSC сред. Развести 10 мкл клеточной суспензии в 10 мкл трипанового синего. Граф клеток с использованием гемоцитометра и рассчитать общее количество ячеек 15. Передача клеток в новые колбы при 1,150 клеток / см 2 в свежей MSC средах и инкубировать в инкубаторе тканевых культур. При такой плотности высева, семена 200000 MSC в каждую новую T175 колбу в 35 мл MSC СМИ. Кормите клетки дважды в неделю до 80-90% сплошности. Семенной последующие проходы в 1,150 клеток / см 2 или 200 000 MSC в каждую колбу Т175. Когда проход 1 (Р1) или P2 клетки сливающийся, криоконсервируют большинство клеток для будущего использования, и переустановку только одну T175 колбу для дальнейшего распространения и определения характеристик. Продвинутые клетки могут быть использованы в P3 или P4 для мезодермальный дифференцировки клеток и анализов характеристик через флвл цитометрии. Примечание: В ранних пассажах, может быть очень мало скудно отделенные колоний, но локальная плотность клеток в каждой колонии может быть очень высокой. Это не идеальное решение, так как локальная плотная упаковка клеток приведет к контактного торможения, задерживая роста и снижения производительности культуры. Мы рекомендуем, когда наблюдаются плотные колонии, клетки должны быть собраны и пересевали в новую колбу. Этот процесс перераспределения обеспечивает клетки с комнатой для быстрого размножения, и общая производительность культуры будет улучшена. Для криоконсервируют MSC, сбор ~ 1 × 10 6 клеток в 1 мл 90% FCS и 10% диметилсульфоксида (ДМСО) и замораживают с использованием стандартных протоколов. Примечание: В разделе результаты репрезентативного, есть описания MSC характеристик с использованием проточной цитометрии, мезодермального дифференциации и анализа FISH XY, чтобы определить пол трех разных (D, CP и CV) расширенных клеточных популяций. В нашем исследовании, плацента были от младенцев мужского пола; Таким образом, всефетальные клетки можно выделить, как мужского (Y-хромосомы) и все материнские клетки можно выделить, как самки (Х-хромосома только).