Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen aus humanen Placenta Gewebe gewonnen

Die Human Research Ethikkommissionen bei Mater Health Services Royal Brisbane und Frauenklinik, Queensland University of Technology und der University of Queensland genehmigt die Forschung und Sammlung von menschlichen Plazenta-Proben in der Studie verwendet. Alle Protokolle mit den nationalen Forschungsrichtlinien eingehalten werden. Patienten erbracht zu Forschungszwecken für die Verwendung von Gewebe schriftliche Zustimmung informiert. Dritten Trimenon Plazenten wurden von gesunden Müttern folgende Routine Sectio (CS) Geburten Begriff aus den oben genannten Krankenhäuser in Brisbane, Australien erhalten. Männliche diskordanten Schwangerschaften Begriff Proben wurden in dieser Studie verwendet, um fötale von mütterlichen Zellen zu unterscheiden. Fetal Geschlecht hatte durch Ultraschall vor der Geburt und / oder visuelle Inspektion des Neugeborenen bei der Geburt durch das Klinikpersonal bestimmt. X und Y – Chromosom – Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) wurde aus der erhaltenen Geschlecht und fötalen oder maternalen Ursprungs des Gewebes weiter zu validieren verwendetOriginal Plazenten. 1. Vor der Ernte, Bereiten Sie die folgenden Hinweis: Bei der Enzymlösungen bilden, die spezifischen Anforderungen und vom Hersteller bereitgestellt Konzentrationen für jedes Produkt befolgt werden sollten. Enzyme werden häufig als rohe Mischung von Proteinen zur Verfügung gestellt, damit ähnliche Enzyme aus verschiedenen Unternehmen sind wahrscheinlich unterschiedliche Aktivitäten / Konzentrationen zu haben. Aus diesem Grund den Rat des Herstellers sollte und Herstellung der Lösung kann modifiziert werden, anerkannt entsprechend werden müssen. Bereiten Sie oder kaufen, 1,5 bis 2 L total steril Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) für dieses Protokoll. Bereiten Sie Kollagenase I-Stammlösung durch Auswiegen Kollagenase Typ I und lösen 1 mg / ml in HBSS und Wirbel sanft vollständige Auflösung zu gewährleisten. Bestimmen das Volumen an HBSS (mit Calcium und Magnesium) erforderlich Kollagenase-Lösung zu 100 Einheiten (U) / & mgr; l (1,000x Stammlösung) zu bringen und dann gefiltert unter Verwendung eines 0,2 &# 181; m-Spritzenfilter. Aliquot 1 ml Volumina in 1,5-ml-Röhrchen und bei -20 ° C bis benötigt. Bereiten Dispase Stammlösung durch Auflösen von unsterilen Dispase bei 10 mg / ml in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) ohne Calcium oder Magnesium. ohne Calcium oder Magnesium in einer Endkonzentration von 2,4 U / ml weiter mit DPBS verdünnt. Filter zu sterilisieren durch einen 0,2 & mgr; m Spritzenfilter. Aliquot 1 ml Volumina in 1,5-ml-Röhrchen und bei -20 ° C bis benötigt. Bereiten Sie Desoxyribonuklase (DNase) -I-Stammlösung durch Auflösen von DNase-I bei 10 mg / ml in 0,15 M NaCl. Filter thorugh ein 0,2 & mgr; m Spritzenfilter. Aliquot 1 ml Volumina in 1,5-ml-Röhrchen und bei -20 ° C bis benötigt. Bereiten Sie die Arbeitsaufschlußlösung durch Kombination von 100 U / ml Kollagenase Typ I, I.5 & mgr; g / ml DNase I und 2,4 U / ml Dispase in serumfreiem DMEM. Frisch auftauen und Enzymbestände unmittelbar vor der Verwendung zu verdünnen. Etwa ein 1: 1-Verhältnis von AufschlußlösungVolumen Gewebevolumen erforderlich ist (beispielsweise 10 ml von Gewebe, in einem 50 – ml – Röhrchen gemessen wird , erfordert 10 ml Aufschlußlösung). Eine Lösung aus 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS und Einstellen auf pH 7,4 15. Speicher 25 ml Aliquots bei -20 ° C für die langfristige oder bei 4 ° C für 1 Woche. Bereiten MSC Kulturmedium aus DMEM-Low Glucose (DMEM-LG), ergänzt mit 1x Antibiotika und Antimykotika-Lösung und 10% nicht hitzeinaktiviertem fötalen Rinderserum. MSC-grade FBS können aus vielen FBS Lieferanten erworben werden. Autoklav sterilisieren Dissektion Ausrüstung im Voraus gemäß Richtlinien des Instituts. Dazu gehören Scheren, Zangen, Skalpelle und eine große Metall Dissektion Fach. Sammeln Sie zusätzliche sterile Gewebekulturkunststoffgeschirr und Verbrauchsmaterialien (zB Skalpellklingen, 50 ml und 15 ml Röhrchen, 25 ml, 10 ml und 5 ml Pipetten und 75 oder 175 cm 2 Zellkulturflaschen). Verwenden Sie Standard-Primärzellkultur Laborausstattung: eine Klasse II biosafety Schrank geeignet für primäre Zellisolierung, Zellkultur – Inkubator bei 5% CO 2 und 37 ° C, einer Wippe in einem 37 ° C Inkubator und einer Zentrifuge mit einem Fassungsvermögen von 50 ml – Röhrchen eingestellt. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung: Laborkittel, 2 Paar Handschuhe (jederzeit), Schutzbrille und nahen Schuhe, die vorne nach Richtlinien des Instituts. Bereiten Sie geeignete Dekontaminationslösungen für den menschlichen Blutproben nach institutionellen Richtlinien und flüssigen biologischen Abfallbehälter im Voraus. 2. Isolierung der Plazentare MSC Herstellung der Placenta Kleid in der erforderlichen persönlichen Schutzausrüstung. Stellen Sie den biologischen Sicherheitsschrank mit benötigten Materialien, Lösungen und Abfallbehälter, das Verfahren zur Durchführung von bis zum enzymatischen Abbau (siehe Abschnitt 2.5.6). Besorgen Sie sich eine Plazenta mit Einwilligung nach Aufklärung und ethische Genehmigung. Sammeln Sie die Plazenta über cesarean section unter aseptischen chirurgischen Bedingungen und Verpackung in einem sterilen Beutel oder Eimer für den Transport zum Labor. Während des Transports und vor der Dissektion, speichern Sie die Plazenta bei Raumtemperatur oder 4 ° C. Hinweis: Tissue können ohne Beeinträchtigung der Zellkulturleistung für bis zu 6 Stunden gelagert werden. Begrenzen Sie die Zeit zwischen Plazenta Sammlung und Gewebeverarbeitung, soweit möglich. Diese Empfehlung basiert auf praktische Fragen. In einigen Fällen haben wir die Zellisolierungsverfahren für bis zu 6 Stunden nach der Geburt verzögert. In diesen Fällen Plazenten wurden bei Raumtemperatur oder 4 ° C (im Labor oder an der Sammelstelle) gehalten. Keine nachweisbaren Unterschiede wurden beobachtet obigen allgemeinen Spender Variation in der MSC aus Plazenten erhalten, wenn sie bei 4 ° C oder bei Raumtemperatur gelagert wurden. Stellen Sie den Behälter mit der Plazenta in der biologischen Sicherheitsschrank. Öffnen Sie den Behälter und übertragen die Plazenta in einen sterilen Behälter. Öffnen Sie die Eihüllen (Fruchtblase oder Amnion-Chorion laeve) 8. Werden mit den Teilen der Plazenta orientiert. Die fetale Seite hat die Nabelschnur Insertion, die in der Regel ist, zentral in der Plazenta eingeführt. Die mütterliche Seite (gefüttert mit Decidua basalis), die an der fetalen Seite gegenüberliegt, hat offensichtliche Kotyledonen (oder Lappen). Um die Präparation beginnen, orientieren die Plazenta mit der Nabelschnur nach oben in den sterilen Behälter. Hinweis: Dieses Protokoll genügend Zellen zu erhalten ist entworfen, um Samen in einem T175-Kolben von jeder der drei Gewebetypen. Jeder Verdau beginnt mit etwa 10 g Gewebe. Dies ist eine ähnliche Ausgangs Anzahl der Fläschchen, wie MSC-Kulturen aus einem 20 ml Knochenmark aspirieren eingeleitet. Wenn mehrere Zellen gewünscht sind, dann kann mehr Gewebe geerntet werden, und das Protokoll kann linear skaliert werden. Die Größen des Gewebes geerntet werden soll nur als Hinweis, was mit dem Plazentagewebe praktisch ist. Es gibt nur wenige defining Merkmale im Plazentazotten, der als Bezugspunkt verwendet werden kann. Die angegebenen Maße dienen als eine Schätzung und die Nabelschnur wird als Meilenstein auf dem fötalen Oberfläche verwendet. Dissektion der Deziduale (D) Gewebe Drehen Sie die Plazenta über so die mütterliche Oberfläche (Decidua basalis) nach oben zeigt. Stellen Sie sicher, dass die fetale Seite mit der Nabelschnur Einfügemarke nach unten zeigt. Schneiden Sie Stücke von 0,5 cm Dicke von der mütterlichen Seite der Plazenta (Decidua basalis Gewebe enthält). Legen Gewebestücke in eine Petrischale mit HBSS während der Präparation hydratisiert die Gewebestücke zu halten. Bringen Sie genügend Gewebe ein Rohr bis zur 10 ml-Marke in einem 50-ml-Röhrchen zu füllen (das etwa 10 g Gewebe). Dissektion der Chorionplatte (CP) Gewebe Mechanisch entfernen der Amnionmembran aus der fetalen Oberfläche der Plazenta (nicht die Fruchtblase), die cho verlassenrionic frondosum (Chorionplatte) intakt. Schneiden Sie Stücke ~ 1 cm breit und 0,5 cm tief von der Chorionplatte. Ernten Sie die Chorionplatte aus der Region am nächsten an der Nabelschnur, weg vom Rand der Plazenta. Legen Gewebestücke in eine Petrischale mit HBSS während der Präparation sie mit Feuchtigkeit versorgt. Bringen Sie ausreichend Gewebe eine 50-ml-Röhrchen bis zur 10 ml-Markierung (~ 10 g Gewebe) zu füllen. Dissektion der Chorionzotten (CV) Gewebe Präparieren CV Gewebe ~ 1 cm 2 x 0,5-1 cm tief aus Plazentagewebe , wo der CP bereits entfernt wurde. Wieder Ernte CV aus der Region am nächsten an der Nabelschnur, weg vom Rand der Plazenta. Versuchen Sie, von der mütterlichen Seite der Plazenta mindestens 1 cm weg zu bleiben (Decidua basalis Gewebe enthält); das Ziel ist, Gewebe aus dem Inneren des plazentaren Zotten Gewebe zu ernten. Legen Gewebestücke in eine Petrischale mit HBSS während der dissection sie mit Feuchtigkeit versorgt. Bringen Sie ausreichend Gewebe eine 50-ml-Röhrchen bis zur 10 ml-Markierung (~ 10 g Gewebe) zu füllen. Mincing und enzymatische Spaltung der D, CP und CV Plazentare Tissues Da es ~ 10 g D, CP oder CV Gewebe in drei verschiedenen 50-ml-Röhrchen, jedes Röhrchen mit ca. 40 ml HBSS füllen und zu invertieren wiederholt das Rohr, um das Gewebe zu waschen (Wiederholung für ~ 10 sec). Den Überstand abgießen und wiederholen Sie diesen Waschschritt 2-3 mal, bis die Lösung weitgehend frei von Blut ist. Verwenden Sie eine 10 ml Pipette oder lange Pinzette die Gewebestücke zu gewährleisten, sind nicht aus der Röhre (n) verloren, wenn der Überstand dekantiert. Rückgewebestücke zu einer 10 cm Petrischale mit einem minimalen Flüssigkeitstransfer. Hieb / Hackfleisch , das Gewebe in feine Stücke von ca. 1-5 mm 3 mit einer Schere oder Rasierklinge. Übertragen Sie die gehackten Gewebe wieder in entsprechend markierten (D, CP oder CV) 50-ml-Röhrchen. In frisch prepared verdauen Medien in mindestens einem 1: 1 – Verhältnis mit dem Gewebe (zB 10 ml Gewebe plus 10 ml Medien verdauen). Setzen Sie die Kappe auf jedem Rohr und invertieren die mehrmals Rohre zu mischen. Inkubiere die Gewebe in den Rohren mit verdauen Medien für 1-2 Stunden bei 37 ° C. Befeuchteter Atmosphäre und 5% CO 2 sind für diesen Schritt nicht erforderlich. Hinweis: Schnelle Schütteln wird benötigt, um effizient zu Zellen aus dem Gewebe dissoziiert und MSC-Ausbeute zu maximieren. Begrenzte Ausbeute wird nur von sehr wenigen Zellen an dem Kulturflasche bei 48 Stunden und einer ersten Durchlaufzeit länger als 1-2 Wochen deutlich. Die Inkubationszeit und Schütteln Methode ist abhängig von der 37 ° C-Inkubator im Labor möglich und kann optimiert werden müssen. Für einen Inkubator mit einem schnellen und steuerbaren Schütteln Mechanismus, Platz Gewebe und zu verdauen Medium in einem 50-ml-Röhrchen oder sterilen Erlenmeyerkolben, in Inkubator und eingestellte Geschwindigkeit auf 250 Umdrehungen pro Minute schütteln. Dies führt zu einem vollständigen Verdau vondas Gewebe in 1 Std. Alternativ kann für einen Inkubator mit einem sanften Schaukeln oder ohne Wippmechanik, schüttelt von Hand den Schlauch schnell und kräftig mit der Hand für 10 Sekunden alle 30 Minuten für 1,5 bis 2 h. Das Enzym Inkubationszeit ist eine geeignete Zeit Abfall zu entsorgen, die biologische Sicherheit Kabinett unnötige Elemente zu löschen, Laborkittel ändern, wenn für den nächsten Teil des Verfahrens, verschmutzt und vorzubereiten. Sammlung von mononukleären Zellen und Oberflächen in Flaschen Anmerkung: Aus dem vorherigen Schritt, gibt es drei 50 ml-Röhrchen (D, CP oder CV) mit Gewebestücken zu verdauen. Wenn die Gewebeaufschlußlösung ein trübes Aussehen und weißen Blutgefäße im Gewebe entsteht offensichtlich sind, ist der Verdau vollständig ist. 30 ml MSC-Medium, das FBS zu jedem Röhrchen, die Enzyme in der Aufschlußlösung enthaltenen, zu inaktivieren. Um die mononukleären Zellen aus dem großen unverdauten Schutt trennen, pulszentrifugieren 50-ml-Tube. Kurz gesagt, erlaubendie Zentrifuge 340 x zu erreichen für 5 s g und dann aufhören. Dadurch wird die große Trümmer Kraft am Boden des Röhrchens zu sedimentieren, während die mononukleären Zellen in flüssiger Suspension zu verlassen. Anmerkung: Die mononukleären Zellen in der flüssigen Phase bleibt, wenn das Rohr nur kurz ist (gepulst) zentrifugiert. Wenn Zentrifugation verlängert wird, werden die mononukleären Zellen auch mit den Gewebestücken am Boden des Röhrchens pelletieren, was zu einer unerwünschten Zellverlust. Die überstehende Flüssigkeit, die einkernigen Zellen enthält, und übertragen diese in einen neuen 50-ml-Röhrchen mit einer Pipette. In 30 ml Medium oder HBSS auf die restlichen Trümmer Plazentagewebe und kräftig schütteln. Dies wird noch freistehende einkernigen Zellen in Suspension zu bringen und eine zweite Ernte von mutmaßlichen MSC aus dem Gewebe zu ermöglichen. Pulszentrifugieren das Rohr ein zweites Mal, und wieder den Überstand in ein neues 50-ml-Tube. Wiederholen Sie diesen Schritt ein drittes Mal die Sammeleffizienz zu maximierenmononukleärer Zellen aus jeder Gewebequelle. Pool die Überstände aus jeder der einzelnen Gewebetypen in zwei 50-ml-Röhrchen. Dies ergeben 6 Rohre insgesamt (2 Tuben jedes D, CP und CV). Zentrifuge jedes Röhrchen für 5 min bei 340 x g. Dieser Schritt wird die mononukleären Zellen auf den Boden der Röhrchen pelletieren. dekantieren oder Pipette vorsichtig den Überstand in den Abfall ab. Es ist unnötig, zu versuchen, jeden Tropfen Überstand zu beseitigen. Hinweis: Das Zellpellet durch eine große Anzahl von roten Blutkörperchen zerbrechlich sein. Achten Sie darauf, nicht aus Versehen das Pellet zu verwerfen, wenn Sie werden direkt aus dem 50-ml-Röhrchen dekantiert. Nachdem die meisten Überstand zu entfernen, Flick sanft das Rohr mehrmals mit einem Finger das Zellpellet zu entfernen. Kombinieren der Pellets, so daß es ein einziges Rohr für jeden D, CP oder CV Gewebe und resuspendieren jeweils in 35 ml von MSC Medien. Optional: Filtern Sie die einkernigen Fraktion durch ein Sieb 100 & mgr; m Maschenzelle gesetzt up in einer 50-ml-Röhrchen Zellklumpen oder Fasermaterial zu entfernen. Hinweis: Vorsicht ist geboten, da die Filter leicht verstopfen können und Überfüllung. Zusätzlich können Luftblasen Filter von der Entwässerung behindern. Wenn dies der Fall ist, heben sich langsam den Filter aus dem Rohr Luft zu ermöglichen, unter dem Filter zu fließen, Waschfilter durch mit Zellkulturmedien oder einen Austausch zu einem neuen Filter. die Filterschritt Ohne erscheint nicht Ausbeute oder Qualität der nachfolgenden MSC Kulturen zu verändern. Gegebenenfalls kann ein rotes Blutkörperchen (RBC) Lyse oder Dichtegradientenzentrifugation in dieser Stufe 15 durchgeführt werden. Aber unsere Erfahrung ist, dass RBC nicht mit MSC-Anhang oder Proliferation stören und daher ist RBC-Lyse nicht erforderlich. Mononukleäre Zellen konnte in diesem Schritt gezählt werden , wenn RBC Entfernung 15 wurde durchgeführt. Zwar wird die überwiegende Mehrheit der Zellen in diesem Stadium nicht MSC, aber fötalen Ursprungs Trophoblasten, Endothelzellen und hämatopoetischen Zellen sowie ma seininterne Herkunft hämatopoetischen Zellen und dezidualen Stromazellen. Übertragen die Zellsuspension für jedes D, CP oder CV Gewebe in einem einzigen T175 – Kolben und die Kultur in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. Beitrag Isolation-Zellen-Expansion Bei 48 Stunden nach der anfänglichen Isolation, entfernen Sie das Medium aus jedem der Kolben (D, CP und CV) und mit 35 ml frischem MSC Medien ersetzen. Das verbrauchte Medium und abgelösten Zellen können verworfen werden, da putative MSC vermutet werden dem Gewebekulturkolben 16 angebracht werden. Rück Kolben in den Inkubator für weitere 24 hr. Nach einer weiteren 24 Stunden der Kultur, wasche die Kolben zweimal mit DPBS (25 ml) und Schutt RBCs zu entfernen. Verwirbeln die Flüssigkeit rund um den Boden des Kolbens RBCs zu entfernen. Verwenden einer Pipette Flüssigkeit und Debris zu entfernen. In 35 ml MSC Medien zu den Kolben und das Rück die Kolben in den Inkubator. Ersetzen Medien zweimal pro Woche, und incubate Kulturen bis in die Zellmonolayern sind 80- 90% konfluent. Diese anfängliche Expansion dauert 4-14 Tagen, je nach der Qualität des Gewebes, Menge an Ausgangsmaterial und die Effizienz und Zeit der Inkubation mit der Aufschlußlösung. 3. Subkultur von PMSC Wenn Kulturen 80-90% konfluent sind, waschen zweimal mit 20 ml 1x HBSS oder DPBS und Waschungen zu verwerfen. In Trypsin-Ersatz zu jedem Kolben (dh verwenden 5 ml für einen T175 – Kolben). Inkubieren der Kolben für 5 min bei 37 ° C MSC von der Gewebekulturoberfläche zu befreien. Tippen Sie auf den Seiten des Kolbens jedes ~ 2 min Ablösung zu erleichtern. Wenn die Zellen von der Oberfläche und in eine Einzelzellsuspension abgelöst werden, wasche die Zellen aus dem Kolben mit MSC Medien und die Zellen in Röhrchen sammeln. Die MSC Medien verdünnen und die Trypsin-Ersatz (Verwendung ~ 15 ml MSC Medien pro T175-Kolben) zu deaktivieren. Übertragen Sie die Inhalte der einzelnen Gewebekulturflasche zu einer 50ml-Tube. Zentrifugenröhrchen bei 340 xg für 5 min, um die Zellen zu pelletieren. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellpellets in 1 ml MSC Medien. Verdünnen Sie 10 ul der Zellsuspension in 10 ul Trypanblau. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und berechnet die Gesamtzahl der Zellen 15. Übertragen Zellen zu neuen Kolben bei 1.150 Zellen / cm 2 in frischen MSC Medien und Inkubation in einem Gewebekultur – Inkubator. An dieser Einsaatdichte, Samen 200.000 MSC in jede neue T175-Kolben in 35 ml MSC Medien. Feed-Zellen zweimal pro Woche, bis 80-90% konfluent. Seed nachfolgenden Passagen bei 1.150 Zellen / cm 2 oder 200.000 MSC in jedem T175 – Kolben. nur ein T175-Kolben für die weitere Vermehrung und Charakterisierung, wenn die Passage 1 (P1) oder P2 Zellen konfluent sind, Kryokonservierung die Mehrheit der Zellen für die zukünftige Verwendung und reseed. Die vermehrten Zellen können bei P3 oder P4 für mesodermalen Differenzierungsassays und Zellcharakterisierung über fl verwendet werdenow-Zytometrie. Hinweis: In frühen Passagen kann es nur sehr wenige dünn getrennt Kolonien, aber die lokale Zelldichte innerhalb jeder Kolonie kann sehr hoch sein. Dies ist nicht ideal, da die lokale dichte Packung der Zellen in Kontakthemmung führen wird, das Wachstum zu verzögern und Kultur Leistung reduziert wird. Wir empfehlen, wenn dichte Kolonien beobachtet werden, sollten die Zellen geerntet und in einen neuen Kolben reseeded werden. Dieser Umverteilungsprozess stellt Zellen mit Raum zu vermehren, und die allgemeine Kultur Leistung verbessert werden. Zur Kryokonservierung MSC, sammeln ~ 1 x 10 6 Zellen in 1 ml 90% FCS und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) und gefrier Verwendung von Standardprotokollen. Hinweis: In der repräsentativen Abschnitt Ergebnisse gibt es Beschreibungen von MSC Charakterisierung fließen mit Zytometrie, mesodermalen Differenzierung und XY-FISH-Analyse das Geschlecht des drei verschiedenen (D, CP und CV) erweitert Zellpopulationen zu bestimmen. In unserer Studie waren Plazenten von männlichen Babys; damit allefötale Zellen könnten als männliche (Y-Chromosom) unterschieden werden und alle mütterlichen Zellen als Weibchen unterschieden werden konnten (X-Chromosom nur).