JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Bakteri ve mantar virüsle enfekte olmuş hücreler üzerinde Biyofilm Başlatma Belirlenmesi

Published: July 06, 2016
doi:
10.3791/54162
, , ,
1Department of Microbiology and Immunology,Midwestern University

Summary

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

Abstract

mantarlar, bakteriler ve virüs içeren taksonomik krallıklar arasında polimikrobiyal etkileşimlerin incelenmesi önceden mikrobiyomları viral üyeleri bu virüs bulaşmış konak hücreleri ile sonraki mikrop etkileşimleri nasıl etkilediği ile ilgili incelenmiş değildir. bakteri ve mantarlar ile virüs birlikte yaşama ağız boşluğu ve genital mukoza yüzeyleri üzerinde esas olarak mevcuttur. Mukozal hücrelerin, kalıcı kronik veya kalıcı geç viral enfeksiyonları, özellikle de ifade edilen reseptör, önemli sayıda virüs değiştirilerek mikrobiyomu üyeleri üzerindeki etkisini ve türü olabilir. Ev sahibi hücre membranı mimarisinde Modifikasyon biyofilm, yani yapışma ilk adımı başlatmak için normal flora ve fırsatçı patojenlerin daha sonraki üye değiştirilmiş yeteneğine neden olur. Bu çalışma, biofil başlatılmasından HSV etkisinin ölçülmesi ve görsel inceleme için bir yöntem tarif ederS. m formasyonu (yapışma) aureus ve C. albicans.

Introduction

İnsan mikrobiyomları vücudunda coğrafi bölgeleri paylaşan birden taksonomik krallıklardan farklı organizmaların içerir. hücre yüzeylerine yapışma mikrobiyomları kolonizasyon sürecinin bir parçasıdır biyofilm, önemli bir ilk adımdır. mikrobiyomları dahil kronik ve inatçı enfeksiyonlara neden virüsler olabilir. Bu virüslerin kronik hücre enfeksiyon, farazi reseptörü durumunu bir değişikliğe neden olabilir. Ek olarak 1,2, hücre içi patojenler ile hücre girişi da sırayla bakteri ve mantarlar da dahil olmak üzere, diğer mikrobiyomları üyelerinin eki değiştirebilir ana membran akışkanlığını / hidrofobiklik etkileyebilecek . İnsan konağın aynı coğrafi bölgelerde lokalize co bu çoklu patojen arasında oluşabilir etkileşimleri anlamak için, biz mukozal yüzeyinde mevcut taksonomik krallıkların spektrumunu temsil patojenlerin etkileşimini incelemek gerekir.

t "> Herpesviridae mikrobiyomu daimi üyeleri olarak insanlarda% 100 mevcut mikropların ailesidir 3,4. Buna ek olarak aynı zamanda sürekli semptomlarının varlığı ve yokluğunda hem döken edilebilir. Spesifik olarak, herpes simplex virüs-1 ve herpes simplex virüs-2 (HSV-1 ve HSV-2 sırasıyla) oronasopharynx ve genital bölgesindeki mikrobiyomu daimi üyeleridir. bağışıklık yetkin kişiler, her iki HSV-1 ve HSV-2 neden gingivostomatit yanısıra genital herpes 5-8. bu bölgelerde, HSV kronik kalıcı nectins, heparan sülfat, lipid sallar ve herpes virüs giriş arabulucu yüzey ifadesinde değişiklikler hücreler sonuçlara HSV 9. entry dökülme viral asemptomatik / tümör nekrozu ile karakterize bir gizli enfeksiyona neden faktör reseptörü (HVEM / TNFR) 10-25. bazı bakteriler ve mantarlar, örneğin, S. aureus ve C. albicans Bu potansiyel olarak ortak temsil alıcıları, fırsatçı patojenler ise,Ayrıca oronasopharynx 26,27 mukozal mikrobiyomları üyeleri olarak bulunabilir. Oronasopharynx S. içinde aureus ve C. albicans kolonizasyon iki ayrı siteler işgal. Doğal diş ana olarak, oral mukoza, HSV-1 ve C tarafından paylaşılır albicans, anterior nazal nares S. tarafından işgal edilirken aureus 28. Ancak, rağmen, in vitro bulgular S. aureus ağız epitel hücrelerine yapışır, 29,30 S. Normal doku 29,30 mevcut olduğunda aureus seyrek Oral örneklerden izole edilir. Küçük klinik bulguların ötesinde genital yol ko-kolonizasyon niş ile ilgili bilinen S. aureus C iken, genital iltihap, akıntı ve disparoni ile karakterize, aerobik vajinit ile ilişkilidir albicans ağız boşluğu 31-35 gözlenene benzer bir mukozal lezyonlar. Böylece, ağız ve genital microbi bu üyelerin her ne kadaronların etkileşimine ilişkin bilinen küçük ome çapraz taksonomik krallıklar konak hücre yüzeyinde 5 bağlılık yoluyla biyofilm oluşumunu başlatmak için bu etkileri kendi yeteneği gibi. Bu protokol etkin bir ko-kolonizasyon / enfeksiyon fonksiyonel sonuçlarını belirlemek amacıyla uygulanmıştır.

Protocol

1. HSV Suşlar ve Taşıma Not: Rekombinan olmayan yayılan HSV-1 (KOS) gL86 ve HSV-2 (KOS) 333gJ – V. Twiari 36,37 tarafından sağlanan kullanılan beta-galaktosidaz raportör etkinliği ile. 1 -80 ° C de, tek bir parça ve deposundan virüs kullanabilir: Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamı,% 20 fetal sığır serumu (FBS) ile (DMEM) 1 oranında ve kullanılana kadar yağsız süt. Viral çok depolama önce, O-nitrofenil-β-D-galactopyranoside (ONPG) ve 5-…

Representative Results

Bu raporda tarif edilen sistem elde edilebilen veri sağlamlık düzeyi Şekil 2, af 38 'de gösterilmiştir. Bu sistemin kullanılmasıyla viral yönden enfekte hücreleri ve birbirlerinin yapışma üzerindeki etkisi ile stafilokok ve mantar etkileşimin modülasyonuna tarif edilebilir. Polimikrobiyal etkileşimi, aynı hücreler üzerinde oluşup oluşmadığını tespit etmek için, Şekil 3 ve 4 38 'de …

Discussion

Şu anda hiçbir bilgi, prokaryot ökaryot ve viral yani çoklu taksonomik etki, çapraz konak mikrobiyomları yarı daimi üyelerinin kalıcı arasındaki karmaşık etkileşimlerin mevcuttur. Bu nedenle S. biyofilm başlamasını incelemek için in vitro model sisteminde bir roman geliştirdi aureus ve C. HSV-1 veya HSV-2 albicans HeLa 229 (HeLa) hücreler 38 etkilemiştir. HeLa hücre model sistem benzersiz bir avantaj sunuyor. Bu, her iki S i?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This project was supported by Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) and Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).

Materials

C.albicans
BBL Sabouraud Dextrose BD 211584
Fungisel Agar Dot Scientific 7205A
S.aureus
Mannitol Salt Agar Troy Biologicals 7143B
Sheep blood agar Troy Biologicals 221239
Hela cells
1xDMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate Corning 10-017-CM
Gentamicin 50mg/ml Sigma 1397 50µg/ml final concentration in the complete DMEM
Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53M EDTA)Solution 1X Corning 25-052-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150 10% final concentration in the complete DMEM
Other medium and reagents
ONPG Thermo Scientific 34055
Ultra-Pure X gal Invitrogen 15520-018
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) Corning 20-021-CV
1XPBS Dot Scientific 30042-500
RIPA Lysis Life Technologies 89901
Staining
Methanol Fisher Scientific A433P-4
HSV 1&2, specific for gD ViroStat 196
DAPI SIGMA D8417-5MG
Gram Crystal Violet Troy Biologicals 212527
Supplies
Petri dish 100X15 Dot Scientific 229693 
Petri dish 150X15 Kord Valmark 2902
96-Well plates Evergreen Scientific 222-8030-01F
24-well plates Evergreen Scientific 222-8044-01F
Culture tubes 100×13 Thomas Scientific 9187L61
Cover slip circles, 12mm Deckglaser CB00120RA1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palu, G., et al. Effects of herpes-simplex virus type-1 infection on the plasma-membrane and related functions of HeLa S3 cells. J Gen Virol. 75, 3337-3344 (1994).
  2. Vitiello, G., et al. Lipid composition modulates the interaction of peptides deriving from herpes simplex virus type I glycoproteins B and H with biomembranes. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1808, 2517-2526 (2011).
  3. Bradley, H., Markowitz, L. E., Gibson, T., McQuillan, G. M. Seroprevalence of Herpes Simplex Virus Types 1 and 2-United States, 1999-2010. J. Infect. Dis. 209, 325-333 (2014).
  4. Szpara, M. L., et al. Evolution and diversity in Human Herpes Simplex Virus genomes. J Virol. 88, 1209-1227 (2014).
  5. Arduino, P. G., Porter, S. R. Herpes Simplex Virus Type I infection: overview on relevant clinico-pathological features. J Oral Pathol Med. 37, 107-121 (2008).
  6. Looker, K. J., Garnett, G. P. A systematic review of the epidemiology and interaction of herpes simplex virus types 1 and 2. Sex. Transm. Infect. 81, 103-107 (2005).
  7. Taylor, T. J., Brockman, M. A., McNamee, E. E., Knipe, D. M. Herpes simplex virus. Front Biosci. 7, 752-764 (2002).
  8. Bernstein, D. I., et al. Epidemiology, clinical presentation, and antibody response to primary infection with Herpes Simplex Virus Type 1 and Type 2 in young women. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 56, 344-351 (2013).
  9. Sacks, S. L., et al. HSV shedding. Antiviral Res. 63, 19-26 (2004).
  10. Brandhorst, T. T., et al. Structure and Function of a Fungal Adhesin that Binds Heparin and Mimics Thrombospondin-1 by Blocking T Cell Activation and Effector Function. PLoS Pathog. 9, (2013).
  11. Green, J. V., et al. Heparin-Binding Motifs and Biofilm Formation by Candida albicans. Journal of Infectious Diseases. 208, 1695-1704 (2013).
  12. Khalil, M. A., Sonbol, F. I. Investigation of biofilm formation on contact eye lenses caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus. Niger. J. Clin. Pract. 17, 776-784 (2014).
  13. Shanks, R. M. Q., et al. Heparin stimulates Staphylococcus aureus biofilm formation. Infection and Immunity. 73, 4596-4606 (2005).
  14. Tiwari, V., et al. Role for 3-O-sulfated heparan sulfate as the receptor for herpes simplex virus type 1 entry into primary human corneal fibroblasts. J Virol. 80, 8970-8980 (2006).
  15. Delboy, M. G., Patterson, J. L., Hollander, A. M., Nicola, A. V. Nectin-2-mediated entry of a syncytial strain of herpes simplex virus via pH-independent fusion with the plasma membrane of Chinese hamster ovary cells. Virol J. 3, (2006).
  16. Di Giovine, P., et al. Structure of Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Bound to the Human Receptor Nectin-1. PLoS Pathog. 7, (2011).
  17. Hauck, C. R. Cell adhesion receptors – signaling capacity and exploitation by bacterial pathogens. Medical Microbiology and Immunology. 191, 55-62 (2002).
  18. Kramko, N., et al. Early Staphylococcus aureus-induced changes in endothelial barrier function are strain-specific and unrelated to bacterial translocation. Int. J. Med. Microbiol. 303, 635-644 (2013).
  19. Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Molecular vision. 17, 3166-3174 (2011).
  20. Sato, R., et al. Impaired cell adhesion, apoptosis, and signaling in WASP gene-disrupted Nalm-6 pre-B cells and recovery of cell adhesion using a transducible form of WASp. Int. J. Hematol. 95, 299-310 (2012).
  21. Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-alpha in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 2878-2887 (2009).
  22. Stump, J. D., Sticht, H. Mutations in herpes simplex virus gD protein affect receptor binding by different molecular mechanisms. J Molecu Model. 20, (2014).
  23. Zelano, J., Wallquist, W., Hailer, N. P., Cullheim, S. Expression of nectin-1, nectin-3, N-cadherin, and NCAM in spinal motoneurons after sciatic nerve transection. Experimental Neurology. 201, 461-469 (2006).
  24. Akhtar, J., et al. HVEM and nectin-1 are the major mediators of herpes simplex virus 1 (HSV-1) entry into human conjunctival epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 4026-4035 (2008).
  25. Heo, S. K., et al. LIGHT enhances the bactericidal activity of human monocytes and neutrophils via HVEM. J. Leukoc. Biol. 79, 330-338 (2006).
  26. . National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report. Am J Infect Control. 32, 470-485 (2004).
  27. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 39, 1093-1093 (2004).
  28. Colacite, J., et al. Pathogenic potential of Staphylococcus aureus strains isolated from various origins. Ann. Microbiol. 61, 639-647 (2011).
  29. Colombo, A. V., et al. Quantitative detection of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa in human oral epithelial cells from subjects with periodontitis and periodontal health. J. Med. Microbiol. 62, 1592-1600 (2013).
  30. Merghni, A., Ben Nejma, M., Hentati, H., Mahjoub, A., Mastouri, M. Adhesive properties and extracellular enzymatic activity of Staphylococcus aureus strains isolated from oral cavity. Microb Pathogen. 73, 7-12 (2014).
  31. Donders, G. G. G., et al. Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. Bjog. 109, 34-43 (2002).
  32. Li, J. R., McCormick, J., Bocking, A., Reid, G. Importance of vaginal microbes in reproductive health. Repro Sci. 19, 235-242 (2012).
  33. Jarvis, W. R. The epidemiology of colonization. Infect Cont Hosp Epidemiol. 17, 47-52 (1996).
  34. Okonofua, F. E., Akonai, K. A., Dighitoghi, M. D. Lower genital-tract infections in infertile nigerian women compared with controls. Genitourin Med. 71, 163-168 (1995).
  35. Nenoff, P., et al. Mycology – an update Part 2: Dermatomycoses: Clinical picture and diagnostics. J Der Deutschen Dermatol Gesellschaft. 12, 749-779 (2014).
  36. Hubbard, S., et al. Contortrostatin, a homodimeric disintegrin isolated from snake venom inhibits herpes simplex virus entry and cell fusion. Antivir. Ther. 17, 1319-1326 (2012).
  37. Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-α in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50, 2878-2887 (2009).
  38. Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Herpes simplex virus (HSV) modulation of Staphylococcus aureus. and Candida albicans.initiation of HeLa 299 cell-associated biofilm. Curr Microbiol. , (2016).
  39. Alva-Murillo, N., Lopez-Meza, J. E., Ochoa-Zarzosa, A. Nonprofessional phagocytic cell receptors involved in Staphylococcus aureus internalization. Biomed Res Internat. , (2014).
  40. Calderone, R. A., Scheld, W. M. Role of fibronectin in the pathogenesis of candidal infections. Reviews of infectious diseases. 9, 400-403 (1987).
  41. Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European journal of cell biology. 79, 672-679 (2000).
  42. Mao, L., Franke, J. Symbiosis, dysbiosis, and rebiosis-The value of metaproteomics in human microbiome monitoring. Proteomics. 15, 1142-1151 (2015).
  43. Christopher, R. A., Kowalczyk, A. P., McKeown-Longo, P. J. Localization of fibronectin matrix assembly sites on fibroblasts and endothelial cells. J Cell Sci. 110, 569-581 (1997).
  44. Heino, J., Kapyla, J. Cellular receptors of extracellular matrix molecules. Current Pharm Des. 15, 1309-1317 (2009).
  45. Hynes, R. O., et al. A large glycoprotein lost from the surfaces of transformed cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 312, 317-342 (1978).
  46. Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology. 24, 389-399 (2005).
  47. Schwarzbauer, J. E., DeSimone, D. W. Fibronectins, their fibrillogenesis, and in vivo functions. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
  48. Abdelmegeed, E., Shaaban, M. I. Cydooxygenase inhibitors reduce biofilm formation and yeast-hypha conversion of fluconazole resistant Candida albicans. J. Microbiol. 51, 598-604 (2013).
  49. Gow, N. A. Germ tube growth of Candida albicans. Current topics in medical mycology. 8, 43-55 (1997).
  50. Liu, Y. P., Filler, S. G. Candida albicans Als3, a multifunctional adhesin and invasin. Eukaryot. Cell. 10, 168-173 (2011).
  51. Lu, Y., Su, C., Liu, H. Candida albicans hyphal initiation and elongation. Trends Microbiol. 22, 707-714 (2014).
  52. Kabir, M. A., Hussain, M. A., Ahmad, Z. Candida albicans: A model organism for studying fungal pathogens. ISRN microbiology. 2012, 538694 (2012).
  53. Ovchinnikova, E. S., Krom, B. P., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Evaluation of adhesion forces of Staphylococcus aureus along the length of Candida albicans hyphae. BMC Microbiol. 12, (2012).
  54. Peters, B. M., et al. Staphylococcus aureus adherence to Candida albicans hyphae is mediated by the hyphal adhesin Als3p. Microbiology-Sgm. 158, 2975-2986 (2012).

Tags

BiofilmViral InfectionOpportunistic PathogensStaphylococcus AureusCandida AlbicansHSVCMVAdenovirusHeLa CellsC. AlbicansGerm TubeYeast FormAdherenceAttachmentMicrobiomeMultiplicity Of InfectionReporter VirusParaformaldehyde GlutaraldehydeDMEMTrypsinHBSSOD 600

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. Exp. (113), e54162, doi:10.3791/54162 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image