A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.
El estudio de las interacciones polimicrobianas a través de los reinos taxonómicos que incluyen hongos, bacterias y virus no se han examinado previamente con respecto a cómo los miembros virales de la microbioma afectan las interacciones microbio posteriores con estas células huésped infectadas por virus. La cohabitación de virus con bacterias y hongos es principalmente presente en las superficies de la mucosa de la cavidad oral y el tracto genital. células de la mucosa, particularmente aquellos con infecciones virales latentes crónicas o persistentes persistentes, podrían tener un impacto significativo en los miembros de la microbioma través de la alteración del virus en el número y tipo de receptores expresados. Modificación en la arquitectura de la membrana de la célula huésped se traduciría en la capacidad alterada de los miembros posteriores de la flora normal y patógenos oportunistas para iniciar el primer paso en la formación de biopelículas, es decir, la adhesión. Este estudio describe un método para la cuantificación y control visual del efecto de HSV en el inicio de biofilm formación (adherencia) de S. aureus y C. albicans.
El microbioma humano incluye diversos organismos de varios reinos taxonómicos que comparten regiones geográficas en el cuerpo. La adherencia a las superficies celulares es un primer paso esencial en la formación de biopelículas, que es parte del proceso de colonización microbioma. Incluido en el microbioma puede haber virus que causan infecciones crónicas y persistentes. La infección de células crónica por estos virus puede causar una alteración en la disponibilidad del receptor putativo. 1,2 Además, la entrada de la célula por patógenos intracelulares también podría afectar a la fluidez de membrana host / hidrofobicidad que a su vez puede alterar la unión de otros miembros microbioma, incluyendo bacterias y hongos . Con el fin de entender las interacciones que pueden ocurrir entre estos múltiples patógenos que co-localizar en las mismas regiones geográficas del huésped humano, debemos ser capaces de estudiar la interacción de los agentes patógenos que representan el espectro de los reinos taxonómicos presentes en la superficie de la mucosa.
t "> El Herpesviridae son una familia de microbios presentes en el 100% de los seres humanos como miembros permanentes del microbioma 3,4. Además, pueden también ser derramada persistente tanto en presencia como en ausencia de síntomas. En concreto, el virus herpes simplex-1 y herpes simplex virus-2 (HSV-1 y HSV-2, respectivamente) son miembros permanentes del microbioma en el oronasopharynx y el tracto genital. en individuos inmunocompetentes, tanto HSV-1 y HSV-2 causa gingivoestomatitis, así como el herpes genital 5-8. en estos sitios, el VHS causa una infección latente, caracterizada por necrosis tumoral asintomática crónica persistente derramamiento viral 9. entrada del VHS en células da lugar a alteraciones en la expresión superficial de nectins, sulfato de heparán, balsas de lípidos y herpesvirus mediador de la entrada / receptor del factor de (HVEM / TNFr) 10-25. Estos receptores representan potencialmente compartidos para algunas bacterias y hongos, por ejemplo, S. aureus y C. albicans, que mientras que los patógenos oportunistas,También puede residir en calidad de miembros de la mucosa del microbioma oronasopharynx 26,27. Dentro de la oronasopharynx S. aureus y C. albicans ocupan dos sitios distintos de la colonización. En los anfitriones con los dientes naturales, la mucosa oral es compartida por HSV-1 y C. albicans, mientras que los orificios nasales nasal anterior están ocupados por S. aureus 28. Sin embargo, a pesar de los hallazgos in vitro que S. aureus se adhiere a las células epiteliales de la boca, 29,30 S. aureus es poca frecuencia aisladas de muestras orales cuando está presente el tejido normal 29,30. Poco se sabe en relación con nichos tracto genital co-colonización más allá de los hallazgos clínicos que S. aureus se asocia con la vaginitis aerobia, que se caracteriza por la inflamación genital, la descarga y la dispareunia, mientras que C. albicans produce lesiones de la mucosa similar a la observada en la cavidad oral 31-35. Por lo tanto, aunque estos miembros de la microbi oral y genitalome reinos taxonómicos transversales poco se conoce acerca de su interacción ya que afecta a su capacidad para iniciar la formación de biopelículas mediante la adhesión a la superficie de la célula huésped 5. Este protocolo se ha aplicado de manera efectiva para determinar las consecuencias funcionales de co-colonización / infección.Actualmente no hay información disponible sobre las interacciones complejas entre permanente a los miembros semi-permanentes del microbioma de acogida que se cruzan múltiples dominios taxonómicos, es decir, procariotas, eucariotas y virales. Por lo tanto, hemos desarrollado un novedoso sistema de modelo in vitro para estudiar la iniciación del biofilm por S. aureus y C. albicans en HSV-1 o HSV-2 infectadas 229 células HeLa (HeLa) 38. El sistema modelo de célu…
The authors have nothing to disclose.
This project was supported by Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) and Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).
C.albicans | |||
BBL Sabouraud Dextrose | BD | 211584 | |
Fungisel Agar | Dot Scientific | 7205A | |
S.aureus | |||
Mannitol Salt Agar | Troy Biologicals | 7143B | |
Sheep blood agar | Troy Biologicals | 221239 | |
Hela cells | |||
1xDMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CM | |
Gentamicin 50mg/ml | Sigma | 1397 | 50µg/ml final concentration in the complete DMEM |
Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53M EDTA)Solution 1X | Corning | 25-052-CI | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% final concentration in the complete DMEM |
Other medium and reagents | |||
ONPG | Thermo Scientific | 34055 | |
Ultra-Pure X gal | Invitrogen | 15520-018 | |
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) | Corning | 20-021-CV | |
1XPBS | Dot Scientific | 30042-500 | |
RIPA Lysis | Life Technologies | 89901 | |
Staining | |||
Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
HSV 1&2, specific for gD | ViroStat | 196 | |
DAPI | SIGMA | D8417-5MG | |
Gram Crystal Violet | Troy Biologicals | 212527 | |
Supplies | |||
Petri dish 100X15 | Dot Scientific | 229693 | |
Petri dish 150X15 | Kord Valmark | 2902 | |
96-Well plates | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | |
24-well plates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
Culture tubes 100×13 | Thomas Scientific | 9187L61 | |
Cover slip circles, 12mm | Deckglaser | CB00120RA1 |