Summary

Détecter Cortex Fragments Pendant bactérienne Spore Germination

Published: June 25, 2016
doi:

Summary

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Abstract

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Introduction

Endospores sont métaboliquement formes dormantes de bactéries qui permettent aux bactéries de persister dans des environnements défavorables. Dans de nombreuses bactéries formant des spores, la formation de spores est induite par une carence en nutriments , mais ce processus peut être contrôlé par des changements à pH, l' exposition à l' oxygène ou d' autres contraintes 1. Alors que dans leur forme de spores métaboliquement dormance, les bactéries résistent rayonnement UV, la dessiccation, des températures plus élevées, et le gel 2. La plupart des connaissances sur le processus de sporulation provient d'études dans l'organisme modèle, Bacillus subtilis. Le processus de sporulation commence avec la réplication de l' ADN et la formation d'un filament de 3,4 axiale. Un septum asymétrique divise ensuite la cellule en deux compartiments de taille inégale. Le grand compartiment, la cellule mère, engloutit plus petit compartiment, préspore. Tant la cellule mère et préspore coordonner l'expression des gènes à mûrir la spore et la cellule mère lyses finalement, libérant le dormant spores dans le milieu environnant 1.

La structure des spores et la composition est conservée dans de nombreuses espèces bactériennes. Le noyau de spores a une teneur en eau inférieure à la cellule végétative et est riche en acide dipicolinique (DPA) 1,2. Au cours de la formation de spores, le DPA est pompée dans le noyau de spores en échange de l'eau. Entourant le noyau est une membrane de spores intérieure où, dans la plupart des bactéries sporulantes, les récepteurs qui reconnaissent les petites molécules qui stimulent la germination germinants (2) sont situés. Situé juste en dehors de la membrane interne de la spore est une couche de peptidoglycane de la paroi cellulaire. Une couche de peptidoglycane spécialisée (cortex) entoure le peptidoglycane de la paroi cellulaire et se compose d'un grand nombre des mêmes composants que le peptidoglycane de la paroi cellulaire [alternance N-acétylglucosamine (NAG) et de l'acide N-acétylmuramique (NAM)]. Toutefois, environ 50% des résidus non alignés dans le cortex ont été convertis en muramique-δ-lactame 5,6 </sup>. Au cours de la germination des spores, ces résidus muramique-δ-lactame sont reconnus par les spores cortex enzymes lytiques (les SCLEs), permettant ainsi le cortex à dégrader (un processus essentiel pour achever la germination), mais pas de la paroi cellulaire. Autour du cortex est une membrane externe et plusieurs couches de protéines d'enveloppe 2.

Contrôle du processus de germination est d'une importance cruciale pour les bactéries formant des spores. Germination est déclenchée lorsque les récepteurs de germination interagissent avec leurs germinants respectifs 2. Dans de nombreuses bactéries formant des spores, ces plantules sont des acides aminés, des sucres, des nucléotides, des ions ou des combinaisons de ces deux. C. difficile la germination des spores est initiée par des combinaisons de certains acides biliaires, [par exemple, l' acide taurocholique (TA)] et des acides aminés (par exemple la glycine) , 7-10. Bien qu'il existe des différences entre le C. voie de germination difficile et les voies étudiées dans d' autres sporuléedes bactéries telles que B. subtilis, commun à tous est l'exigence absolue de dégrader le cortex de spores pour permettre à une cellule végétative de croître à partir de la spore germée 2,8. La dégradation de Cortex peut être accompli par le SCLEs CWLj / SLEB (que l'on trouve dans B. subtilis) ou SLEC (que l'on trouve dans de nombreux Clostridia). Cortex hydrolyse réduit la contrainte sur la paroi cellulaire et de la spore. Cela permet noyau pleine réhydratation, une étape nécessaire dans réactivant la plupart des protéines nécessaires pour le métabolisme cellulaire 2.

Lorsque les spores germent, les spores dormantes passe d'un état de phase lumineuse à un état de phase sombre et ce processus peut être mesurée par un changement de densité optique (DO) à 600 11 nm. Un précédent rapport suggère qu'une grande partie de ce changement de OD est due à la libération de DPA de la spore 12. Au cours de notre étude récente, nous avons cherché à comparer le moment de C. difficile la germination des spores et la surveillancelibération de DPA et cortex fragments 9. Pour cette étude, il était essentiel de surveiller la libération de fragments de cortex comme ils ont commencé à être libéré par la germination des spores.

Le dosage colorimétrique utilisé ici a été basé sur une méthode de détection des sucres avec des extrémités réductrices développé Ghuysen et al. 13. Parce que d' autres ont décrit des protocoles pour la détection des sucres réducteurs 14 ou ont modifié les protocoles 15, la littérature sur ce sujet peut être déroutant. Ici, nous détaillons une méthode étape par étape pour la détection colorimétrique de sucres réducteurs libérés de germant C. Les spores difficile. Bien que cette étude utilise C. Les spores difficile, les sucres réducteurs libérés au cours de la germination des spores provenant d' autres bactéries formant des spores puissent être détectées avec ce protocole 9,16,17.

Protocol

1. Échantillons Génération Heat activer C. difficile spores à 65 ° C pendant 30 min et magasin sur la glace. Remarque: C. Les spores difficile peuvent être produits et purifiés comme décrit précédemment 7,9,10. Préparer la solution de germination à X + 1 ml où X est le nombre d'échantillons à prélever au cours de l'essai. Remarque: La solution de germination est spécifique aux espèces de bactéries SPORE à l'étude. P…

Representative Results

Le tableau 1 présente des résultats typiques en utilisant des normes NAG. Les données sont utilisées pour générer une courbe standard. Le tableau 2 montre des résultats typiques d'un essai de germination dans un tampon de germination supplémenté avec de la glycine 100 mM et TA 10 (conditions de germination favorisant) ou mM de glycine 100 uniquement (conditions de non-germination). En l'absence de TA, C. spores Difficile</em…

Discussion

Lors de la stimulation, les spores subissant le processus de germination perdent leurs propriétés de résistance, sans la nécessité de la synthèse macromoléculaire. Lorsque la germination des spores est déclenchée, le noyau de spores libère DPA en échange d'eau 2. En raison de la forte teneur en DPA de la spore dormante, le noyau de spores est sous pression osmotique intense et le peptidoglycane spécialisé, cortex, aide à prévenir le noyau de l' enflure en agissant, sans doute, comme un …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le projet décrit est soutenu par le Prix Numéro 5R01AI116895 de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses. Le contenu est uniquement la responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses ou de la National Institutes of Health.

Materials

2.0 mL screw cap tube USA scientific 1420-3700
p1000 eppendorf pippet Eppendorf
p200 eppendorf pippet Eppendorf
p20 eppendorf pippet Eppendorf
100-1250uL pipet tips VWR 89079-486
1-200uL pipet tips VWR 89079-458
N-acetyl-D-glucosamine Sigma A3286-25G
Hydrochloric Acid – 10N BDH-Aristar BDH3032-3.8LP
Acetic Anhydride Alfa Aesar L04295
Sodium Bicarbonate BDH BDH0280-500G
Potassium Tetraborate tetrahydrate Alfa Aesar 39435
Sodium Hydroxide BDH BDH8019-500G
4-(Dimethylamino)benzaldehyde Sigma 156477-100G
Saturated Phenol Fisher BP1750-400
2-Mercaptoethanol Aldrich M6250-100ML
SpectraMax M3 Molecular Devices
Acetic Acid, Glacial BDH BDH3098-3.8LP
Heated, Circulating Water Bath VWR Scientific Model 1136
Microtest 96 Falcon 353072 96 well clear tissue culture plates
Culture tubes VWR 89000-506
Lyophilizer
Heat Blocks
Vortex Machine

References

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Cite This Article
Francis, M. B., Sorg, J. A. Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination. J. Vis. Exp. (112), e54146, doi:10.3791/54146 (2016).

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