Стратегическая эндотелиальных клеток Tube Формирование анализа: Сравнение внеклеточного матрикса и фактор роста Снижение внеклеточного матрикса
Summary
This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.
Abstract
Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient’s blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.
Introduction
Для того чтобы получить питательные вещества, необходимые для выживания, злокачественные опухоли требуют доступа к потоку крови пациента. Чтобы получить доступ , что опухолевые клетки выделяют химические сигналы , которые стимулируют рост новых кровеносных сосудов в опухоли, таким образом , угон нормальный физиологический процесс , известный как ангиогенез 2. Кроме того , через кровеносные сосуды , созданных с помощью ангиогенеза , что метастаз (то есть, распространение рака в другие органы) может произойти. Так как процесс ангиогенеза является столь жизненно важной для прогрессированию такого широкого разнообразия видов рака, она является привлекательной мишенью в исследовании противоопухолевой терапии 3.
Один метод, используемый для количественного определения ангиогенеза является измерение способности клеток-предшественников эндотелиальных, чтобы образуют трубки при размещении на внеклеточного матрикса. Поскольку образование этих труб является критически важным первым шагом в ангиогенеза, тестирование условий окружающей среды (например, наличие или отсутствие данного сотрудничестваформирование mpound), которые могут стимулировать или ингибировать трубка дает представление о конкретных шагах, которые могут быть направлены на ингибировать ангиогенез. Клетка трубка Анализ образования эндотелиальной является одним из наиболее широко используемых методов 4 в пробирке , что измеряет способность клеток к образованию трубок. Это простой тест, требующий относительно небольшого числа компонентов и период короткой культуры 5. Возможно, самое главное, однако, заключается в том, что данные, полученные от этого вида анализа является количественной оценке.
Пример для использования анализа формирования трубки включает в себя сравнение развитие труб из сосудистых эндотелиальных клеток, выращенных на внеклеточный матрикс против фактора роста снижается (СКФ) внеклеточного матрикса. Внеклеточный матрикс представляет собой базальную мембрану, как материал, выделенный из клеток саркомы и его основными компонентами являются ламинин, тип IV коллаген, факторы роста и протеогликаны. Некоторые соединения оказывают различное влияние на способности клеток для формирования трубки, когда всреда с пониженными факторами роста и снижение гепарансульфат протеогликанов (HSPGs). HSPGs являются компонентом внеклеточного матрикса, который значительно снижается в GFR внеклеточного матрикса. В качестве примера, если гипотеза состоит в том, что ингибиторы ангиогенеза, такие как SB225002, который блокирует Рецептор CXCR2, имеют значительно более слабую способность прерывать образование трубки при HSPGs обильны, то сравнение между образованием трубки активности в внеклеточного матрикса и СКФ внеклеточного матрикса важную роль в исследовании возможности ингибирования ангиогенеза с помощью контроля HSPGs.
Другие анализы, которые обычно используются для определения влияния соединений на ангиогенез в естественных условиях методами. Яркими примерами этого являются хорионалантоисной мембраны (САМ) анализ 6 с использованием куриных яиц, а также в естественных условиях Матригель плагин ангиогенеза анализа 7 с использованием мышей. В то время как методы в естественных условиях измерения ангиогенеза в три размеры и являются более репрезентативными человеческого тела по сравнению с экстракорпорального трубкой анализа образования в России , они страдают изъяном требует значительно больше времени и значительно труднее выполнить. И САМ – анализ и анализ внеклеточной плагин принимать по крайней мере неделю 8 делать, в то время как в сравнении, анализ формирования трубки может быть сделано в течение одного дня и не требует использования животных.
Важно отметить, что эндотелиальные клетки, используемые в настоящем докладе, являются Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC). Эти клетки играют ключевую роль в сосудистой прорасти и рост кровеносных сосудов, и в достаточной степени аналогичны эндотелиальными клетками в раковых образований, которые будут использоваться для оценки анти-ангиогенеза активности в в пробирке и в естественных условиях экспериментов 9. Также могут быть использованы и другие клетки, такие как первичные микрососудистых эндотелиальных клеток.
Важно также отметить, что помимо того, что ниже,уровни HSPGs, СКФ внеклеточный матрикс также пониженные уровни многих компонентов, по сравнению с нормальной внеклеточного матрикса. Это включает в себя, но не ограничиваясь ими: EGF, IGF-1, PDGF и TGF-бета. Те, осуществляющие эксперименты по изучению значимости этих соединений по отношению к ангиогенеза могут быть заинтересованы в использовании СКФ внеклеточный матрикс.
Protocol
Representative Results
Discussion
При проведении этого анализа, важно, чтобы держать внеклеточный матрикс на льду или при 4 ° С в любое время, если не указано иное. Если внеклеточный матрикс дают нагреться выше 4 ° С, она будет полимеризоваться, и анализ будет разрушена. Важно также , чтобы убедиться , что все , что входит в контакт (например, пипетки советы, пластина) с внеклеточным матриксом предварительно охлаждается для вышеупомянутой причине. Число клеток высевали в каждую лунку имеет решающее значение, слишком мало клеток не дает ожидаемого полотна в контрольном образце, слишком много клеток образуют большие кластеры клеток или монослой, и анализ не будет действительным. Еще одним важным фактором успеха этого анализа является клетка проход номер HUVECs. Номер прохода всегда должно быть ниже, чем десять, в противном случае формирование надежной трубка не может произойти. Кроме того, следует убедиться, что среда для культивирования клеток используется не истек, или клетки не будет жизнеспособным. Alternatраторов, можно Аликвотировать среды и ее компонентов, и хранить их при температуре -20 ° С, чтобы сохранить в течение определенного периода времени после истечения срока годности. Конечно, он по-прежнему предпочтительней использовать среду до истечения срока действия
Как и все процедуры, есть некоторые недостатки проведения анализа формирования эндотелиальных клеток трубки. Одной из основных проблем является то, что, так как существуют различные типы эндотелиальных клеток и матриц поддержки, результаты анализа могут значительно варьироваться в зависимости от используемого типа клетки и матрицы. Эндотелиальные клетки, используемые (HUVECs, HAECs или HMVECs) являются первичные клетки, они являются дорогостоящими, чтобы получить и имеют изменчивость по сравнению с иммортализованных клеток. Первичные клетки имеют ограниченные проходы для использования, и поэтому не подходят для долгосрочных экспериментов ангиогенеза 14. Для получения достоверных данных, всегда следует использовать те же типы для анализа. Как и в других анализах , в лабораторных условиях , результаты анализа на образование трубки должны быть конукрепились в естественных условиях, так как результаты от контролируемых и искусственных условиях двумерной культуре ткани не всегда может быть отражено в комплексном биосистемы живого организма. Важно также иметь в виду, что этот тип анализа может быть использован только для демонстрации образование эндотелиальных клеток трубки, и не должны быть использованы для проверки других, не эндотелиальной трубки, образующей клетки.
Этот анализ является довольно простой и быстрый способ для количественного определения ангиогенный потенциал соединения. Он также образует платформу для дальнейших экспериментов, так как в одиночку, он не дает информации о конкретном механизме, посредством которого соединение на самом деле влияет на процесс формирования сосудов. Тем не менее, использование разнообразных внеклеточных матриц является примером того, как в дальнейшем создать основу для исследовательских вопросов, которые обычно не используется. Есть подходы к изучению конкретных био-химических механизмов соединения, включая специфические ингибиторы, которые нацелены на компонентыангиогенез путь. Другой подход может извлечь РНК из эндотелиальных клеток и использовать RT-PCR (ПЦР в реальном времени) 12 для анализа изменений экспрессии генов , которые могут вызвать поведение роста наблюдается в анализе. Будущие приложения этого метода включают трансфицировали HUVECs для создания нокдауна анализов для конкретных стадий ангиогенеза. Существует потенциал для применения этого подхода для изучения лимфангиогенез пути. Изменяя компоненты внеклеточного матрикса, взаимодействие матрицы и клеточного процесса, поддерживающие ангиогенез при раке может быть дополнительно выяснены. Выделение РНК и белков из эндотелиальных клеток при этих условиях обеспечивают дополнительные количественные данные, соответствующие визуализации данных.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was funded by the Fund for Medical Research and Education, Wayne State University, Detroit, MI.
Materials
| EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 ) | Fisher | NC9525043 | HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin. Aliquot the medium and its components and store them at -20 oC, warm in 37 oC before use. |
| MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10mL; LDEV-Free | Fisher | CB-40230 | Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in -20 oC , warm in 4 °C before use. |
| MATRIGEL MATRIX 10ML ; 10mL; LDEV-Free | Fisher | CB-40234 | extracellular matrix, keep in -20 oC, warm in 4 °C before use. |
| SB225002 | Fisher | 559405 | CXCR2 inhibitor, keep in -20 oC, warm in room temperature before use. |
| Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ScienCell Research Laboratories | 8000 | culture it according reference 10. |
| Trypsin 0.05%-EDTA phenol red | Invitrogen | 25300-054 | keep in 4 oC, warm in 37 oC before use. |
| Nikon ECLIPSE Ti | Nikon | Inverted Research Microscope. | |
| NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit | Nikon | Inverted Research Microscope software | |
| Graph-pad Prism 5 | GraphPad Software, Inc. | scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50. |
References
- Sharma, B., Nawandar, D. M., Nannuru, K. C., Varney, M. L., Singh, R. K. Targeting CXCR2 enhances chemotherapeutic response, inhibits mammary tumor growth, angiogenesis, and lung metastasis. Mol Cancer Ther. 12 (5), 799-808 (2013).
- Birbrair, A., et al. Type-2 pericytes participate in normal and tumoral angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol. 307 (1), 25-38 (2014).
- Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
- Speyer, C. L., Hachem, A. H., Assi, A. A., Johnson, J. S., DeVries, J. A., Gorski, D. H. Metabotropic glutamate receptor-1 as a novel target for the antiangiogenic treatment of breast cancer. PLoS One. 9 (3), 88830 (2014).
- Gu, X., et al. Human Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease siRNA Inhibits the Angiogenesis Induced by X-Ray Irradiation in Lung Cancer Cells. International Journal of Medical Sciences. 10 (7), 870-882 (2013).
- Manjunathan, R., Ragunathan, M. Chicken chorioallantoic membrane as a reliable model to evaluate osteosarcoma-an experimental approach using SaOS2 cell line. Biol Proced Online. 17, 10 (2015).
- Nidhyanandan, S., Boreddy, T. S., Chandrasekhar, K. B., Reddy, N. D., Kulkarni, N. M., Narayanan, S. Phosphodiesterase inhibitor, pentoxifylline enhances anticancer activity of histone deacetylase inhibitor, MS-275 in human breast cancer in vitro and in vivo. Eur J Pharmacol. 764, 508-519 (2015).
- Li, Y., et al. Copper improves the anti-angiogenic activity of disulfiram through the EGFR/src/VEGF pathway in gliomas. Cancer Lett. Aug. , (2015).
- Park, H. J., Zhang, Y., Georgescu, S. P., Johnson, K. L., Kong, D., Galper, J. B. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Rev. 2 (2), 93-102 (2006).
- de Wit, C., Fautz, C., Xu, Y. Real-time quantitative PCR for retrovirus-like particle quantification in CHO cell culture. Biologicals. 28 (3), 137-148 (2000).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells for derived from umbililcal veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
