Stratejik Endotel Hücre Tüp Oluşumu Testi: Azaltılmış Ekstrasellüler Matrix Ekstrasellüler Matrix ve Büyüme Faktörü Karşılaştırılması

1. Hücre Kültürü Tohum 3×10 75 cm bir şişe içinde, tam büyüme ortamında 10 10 ml 5 HUVEC hücreleri. 70-80% konfluansa CO2,% 5 37 ° C'de inkübe hücreleri. 2. borucuk oluşumu Deneyi 4 ° C 'de bir gece boyunca buz üzerinde büyüme faktörü azaltılmış (GFR) hücre dışı matrisi veya normal hücre dışı matrisi ya da çözülme. Not: 'ekstraselüler matriks' kısalık uğruna bundan sonra GFR ve normal hücre dışı matriks hem başvurmak için kullanılır. bunları hazırlamak için proses ile aynıdır. Buz üzerinde 96 oyuklu kültür plakaları tutmak ve de önceden soğutulmuş ipuçlarını kullanılarak göz başına soğutulmuş hücre dışı matrisin 50 ul ekle. Yalnızca normal hücre dışı matriks içeren 5 kuyu üç kopya hazırlayın. Sadece GFR hücre dışı matriks içeren 5 kuyu başka üç nüsha hazırlayınız. 30 dakika boyunca 37 ° C'de 96 oyuklu plaka inkübe edin. HUVECler yıkayınbir kez fosfat tamponlu kalsiyum ve magnezyum (PBS) olmadan çözelti ve 1 ml% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. En Hücreler kadar yuvarlak kadar hücreleri her dakika kontrol 1-5 dakika süreyle 37 ° C'de çanak inkübe edin. bir kez balon dokunarak hücreleri çıkarmak. 5 ml bazal ortamı ekleme% 1 Fötal Sığır Serumu (FBS) ile (herhangi bir şey, yani endotelyal hücre büyüme ortamı (örneğin, ek) ilave edildi). pipetleme şişede hücreleri toplamak ve 15 ml'lik bir tüpe transfer. 5 dakika boyunca 200 xg'de hücreleri Santrifüj ve supernatant atın. 2 ml bazal ortam ile yeniden askıya hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve 2-3 x 10 5 hücre / ml hücre yoğunluğu ayarlanır. bazal ortamda CXCR2 önleyicisi SB225002 aşağıdaki 10x konsantrasyonlarda 100 ul hazırlanması: 11 uM, 5.6 uM, 1.1 uM, 0.56 uM ve 0 uM (kontrol). Her 5 MICR içine HUVEC süspansiyon 300 ul pipetocentrifuge borular. inhibitör konsantrasyonu 33 ul ekle (11 uM, 5.6 uM, 1.1 uM, 0.56 uM ve 0 uM), bir tüp içine HUVECler ve vorteks içeren. Pipet hücre dışı matrisin ayrı ayrı gözlere hücre süspansiyonları (1-1.5 x 10 4 hücreleri) her birinin 50 ul. Üç kez, her süspansiyon plaka ve 37 ° C'de,% 5 CO2 seviyesinde 4-16 saat süreyle inkübe edin. 4-16 saat sonra, iyi bir ters mikroskop kamera 11 (orijinal büyütme x 100) ile başına oluşan tüplerin 4 fotoğraf çekmek. 3. tübül bozulması Testi Tüp Oluşumu Testi (2.3 2.1 adımları) ile aynı özelliklere göre hücre dışı matriks ve tabak hazırlayın. 'Deki gibi 2.4- tüp formasyonu deneyi ve kısım 2.4.2 hücre dışı matris içeren bir 96-çukurlu plaka içinde göz başına 50 ul olmak HUVEC süspansiyonu hazırlanır. Not: Yeterince kuyu s PlakalıBu o ilaç tedavisine başına 3 kuyu vardır. 37 ° C'de 4 saat hücre dışı matris üzerinde hücreler büyümek,% 5 CO2. İlaç tedavisine başlanmadan önce görüntüleri çekin. Tüp formasyonu deneyi Aşama 2.5 de tarif edildiği gibi CXCR2 önleyicisi SB225002 2x konsantrasyonları hazırlamak ve HUVECler içeren 96 çukurlu bir levhanın her çukuruna Her konsantrasyondan 50 ul ekle. üç nüsha halinde her konsantrasyon Plate. 37 ° C'de bir 2-12 saat boyunca inkübasyona bırakılır,% 5 CO2. Iyi 11 (100 × orijinal büyütme) ters bir mikroskop kamera kullanarak her birinde oluşan tüplerin 4 fotoğraf çekmek. 4. ükler Verileri mikroskop kamera yazılımı kullanarak dört rastgele mikroskobik alanlarda boruların toplam boru uzunluğu ölçülerek görüntülerde yakalanan tüp oluşumunu değerlendirin. mikroskop kamera yazılımı görüntüyü açın ve 'Annotations ve Ölçümleri tıklayın9 ;. 'Uzunluk' bölümü altında, 'basit çizgi' aracını seçin. daha sonra sağ tıklayın, tüpün uzunluğu boyunca bir çizgi çizin, resmin üzerine tıklayın. Not: Yazılım otomatik piksel hattının uzunluğunu hesaplamak ve bir dosyaya veri koyacağız. 'Basit çizgi' aracını seçerek görüntüdeki tüm boru hatları için aynı işlemi tekrarlayın. daha sonra sağ tıklayın, tüpün uzunluğu boyunca bir çizgi çizin, resmin üzerine tıklayın. Not: Yazılımın her satırın uzunluğunu kaydetmek ve ekranda verileri görüntüler. Resimde her tüp ölçüldükten sonra, daha sonra, 'Export' tık 'e-tabloya Uzunluğu' seçti. Not: uzunluk verileri bir elektronik tablo ihraç edilecek. Toplam tüp uzunluğunu almak için e-tablodan boru uzunlukları tüm ekleyin. Hesaplayın ve tüplerin ortalama uzunluğu kaydedin. Not: Dört çoğaltır ortalama ve belirlenen standart sapma ile tavsiye edilir. Ekstrasellüler Matriks Kültür 5. kurtarma hücreler Kültür ve bir tüp formasyonu deneyi gerçekleştirmek yeterli hücre sayısını vermez, 96 gözlü bir levha olarak daha büyük bir ölçekte (bakınız bölüm 2). 12 gözlü levhalar için, hücre dışı matrisin 500 ul ve HUVEC hücre süspansiyonu 500 ul (1.5×10 5 hücreleri) kullanın. tüpler oluşturmak üzere 4-16 saat boyunca inkübe hücreleri. Daha sonra, hücre kültür ortamı aspire. kalsiyum ve magnezyum içermeyen soğuk 1 x PBS, 1 ml hücre durulayın. Kültür üzerine soğuk PBS-2.5 mM EDTA tampon 1 ml ilave edilir ve 10 dakika boyunca buz üzerinde tutulur. yıkama, ucu kesilmiş bir 1000 ul pipet kullanarak çanak hücreleri ve hücre dışı matris karışımı yerinden çıkarır ve daha sonra soğuk bir 15 ml tüp transferi de 4 ml buz gibi soğuk PBS-2.5 mM EDTA ve tüp içine yerleştirilmiş . 1-4 saat boyunca buz üzerinde tüpler koyun ve hücre dışı her kadar tüpü birkaç kez ters çevirinMatris çözündürülür. 0 ° C'de 1.620 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj Buz üzerinde bir 1.ml tüpüne 1 ml soğuk PBS ile hücre pelletleri yeniden askıya. Yine 0 ° C'de 3,000 x g'de 5 dakika boyunca, daha sonra üstte kalan sıvı kısmın bertaraf santrifüjlenir. -80 ° C hücreleri saklayın.