Ein-Schritt-Negative chromatographischer Reinigung von<em> Helicobacter pylori</em> Neutrophil-aktivierendes Protein überexprimiert in<em> Escherichia coli</em> Im Batch-Modus

Helicobacter pylori (H. pylori) ist eine Hauptursache von Gastritis und Magengeschwüren. Dieses Bakterium ist auch als Karzinogen beim Menschen von der Internationalen Agentur für Krebsforschung, Teil der Weltgesundheitsorganisation im Jahr 1994 eingestuft Es wurde geschätzt , dass die Prävalenz von H. pylori – Infektion ist 70% in den Entwicklungsländern und 30-40% in den Industrieländern ^1. Auch wenn die Infektionsrate von H. pylori wird in den Industrieländern abnimmt, die Infektionsrate von H. pylori in den Entwicklungsländern ist ² immer noch hoch. Die Standardbehandlung H. auszurotten pylori – Infektion besteht aus der Verabreichung eines Protonenpumpenhemmers, PPI, und zwei Antibiotika, Clarithromycin und Amoxicillin oder Metronidazol ^3. Allerdings ist der Anstieg der Antibiotikaresistenz in der H. pylori verwandtes Geschwür Therapie die Entwicklung neuer Strategien drängt o zu verhindernr die Infektion zu heilen. Entwicklung von präventiven und / oder therapeutischen Impfung gegen H. pylori könnte einen alternativen Ansatz bieten H. zu steuern pylori – Infektion.

Neutrophilen-aktivierende Protein Helicobacter pylori (HP-NAP), ein wichtiger Virulenzfaktor von H pylori, wurde zuerst in Wasserextrakten von H. identifiziert pylori mit der Fähigkeit , Neutrophile zu aktivieren , um an endotheliale Zellen anheften und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) ⁴ herzustellen. Neutrophile Infiltration der Magenschleimhaut in H. gefunden pylori – infizierten Patienten mit aktiver Gastritis kann bei der Entzündung und Gewebeschädigung des Magens führen. So Neutrophilen eine pathologische Rolle spielen , indem sie die Aktivierung HP-NAP kann eine Magenentzündung zu induzieren, die weiter Geschwür oder H. verursacht pylori -assoziierten Magenerkrankungen. Dennoch ist HP-NAP ein potentieller Kandidat für die klinische Anwendung ^5,6. Aufgrund der immunogene und immunmodulatorische Proschaften von HP-NAP könnte dieses Protein verwendet werden, um Impfstoffe, therapeutische Mittel und Diagnose-Tools zu entwickeln. Eine klinische Studie wurde unter Verwendung von rekombinantem HP-NAP als eine der Komponenten eines Proteins Impfstoff gegen H. durchgeführt pylori. Dieser Impfstoff besteht aus rekombinanten HP-NAP, Cytotoxin-assoziierte Gen A (CagA) und vacuolating cytotoxin A (VacA) Proteine ​​mit Aluminiumhydroxid formuliert und hat sich weiter beim Menschen sicher und immunogen zu sein ⁷ gezeigt. Auch wirkt HP-NAP als ein potenter Immunmodulator T – Helfer Typ 1 (Th1) -polarisierte Immunantworten für die Krebstherapie ⁸ und nach unten zu regulieren Th2-vermittelte Immunreaktionen durch allergische Reaktionen und parasitäre Infektionen ^9,10 ausgelöst auszulösen. Wie für die Diagnostik, wurde Serum – Antikörper gegen HP-NAP in H. zu erkennen rekombinanten HP-NAP-basierten ELISA angewendet pylori – infizierten Patienten ^11. Eine Studie zeigte , dass der Pegel des HP-NAP-spezifische Antikörper in Seren von H. pylori -infizierten Patienten mit Magenkrebs als die ¹² von Patienten mit chronischer Gastritis signifikant höher war. Eine andere Studie zeigte auch , dass Serumantikörper gegen HP-NAP mit der Anwesenheit von nicht-Cardia Adenokarzinom des Magens ¹³ verbunden sind. So können rekombinante HP-NAP-basierten ELISA Serum – Antikörper gegen HP-NAP für die Prognose von Magenkrebs in H. zu erkennen , anzuwenden pylori – infizierten Patienten. Zusammengenommen können das gereinigte HP-NAP weiter für die Prävention, Behandlung verwendet werden, und die Prognose von H. pylori -assoziierte Erkrankungen sowie Krebstherapie.

Unter den verschiedenen zur Reinigung von rekombinantem HP-NAP Methoden exprimiert in Escherichia coli (E. coli) in seiner nativen Form berichtet so weit, einem zweiten Reinigungsschritt beteiligt Gelfiltrationschromatographie hochreines HP-NAP zu erhalten , ist erforderlich ^14-16 . Hier wird ein Verfahren unter Verwendung von negativen Modus batch-Chromatographie mitDiethylaminoethyl (DEAE) Ionenaustauscherharzen wird zur Reinigung von HP-NAP beschrieben überexprimiert in E. coli mit hoher Ausbeute und hoher Reinheit. Dieses Reinigungsverfahren wurde auf die Bindung von Wirtszellproteinen basieren und / oder anderen Verunreinigungen als HP-NAP auf das Harz. Bei pH 8,0, fast keine andere Proteine ​​außer HP-NAP werden aus der ungebundenen Fraktion gewonnen. Diese Reinigung Ansatz unter Verwendung von DEAE-Ionenaustausch-Chromatographie in negativen Modus ist einfach und zeitsparend durch Reinigung von rekombinantem HP-NAP über Einstufen-Chromatographie durch die Erhebung von der ungebundenen Fraktion ermöglicht. Neben HP-NAP mehrere andere Biomoleküle, wie beispielsweise ¹⁷ Viren, Immunoglobulin G (IgG) ^18, Hämoglobin ^19, Proteinphosphatase ²⁰ und Virulenzfaktor Flagellin – ^21, wurden auch durch Ionenaustauschchromatographie zu reinig in negativer berichtet Modus. Der negative Modus wird für die Ionenaustauschchromatographie bevorzugt, wenn die Verunreinigungen gering sindvorhandenen Komponenten in der Probe unterzogen , bis ²² gereinigt werden. Die Anwendung der negativen Chromatographie bei der Reinigung von natürlichen oder rekombinanten Biomoleküle wurde ²³ vor kurzem überprüft.

Der vorliegende Bericht liefert eine Schritt für Schritt – Protokoll für die Expression von rekombinanten HP-NAP in E. coli, Lyse der Zellen und die Reinigung von HP-NAP unter Verwendung von negativen Modus batch – Chromatographie mit DEAE – Ionenaustauschharze. Wenn ein Protein für die Reinigung erwünscht für Ionenaustauschchromatographie in Negativmodus geeignet ist, könnte das beschriebene Protokoll auch als Ausgangspunkt für die Entwicklung eines Reinigungsverfahrens angepasst werden.