Summary

Ein Enzym- und Serumfreie Neural Stem Cell Culture Modell für EMT Investigation Geeignet für Drug Discovery

Published: August 23, 2016
doi:

Summary

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.

Abstract

Epithelial zu mesenchymale Transition (EMT) beschreibt den Prozess der Epithel Transdifferenzierung zu Mesenchym. EMT ist ein fundamentaler Prozess während der embryonalen Entwicklung, die auch tritt häufig bei Glioblastom, der häufigsten bösartigen Hirntumor. EMT wurde auch in mehreren Karzinomen außerhalb des Gehirns einschließlich Brustkrebs, Lungenkrebs, Dickdarmkrebs, Magenkrebs beobachtet. EMT ist zentral zur Malignität verknüpft durch die Förderung von Migration, Invasion und Metastasenbildung. Die Mechanismen der EMT Induktions sind nicht vollständig verstanden. Hier beschreiben wir ein in vitro – System für standardisierte Isolation kortikaler neurale Stammzellen (NSC) und anschließender EMT-Induktion. Dieses System bietet die Flexibilität, entweder einzelne Zellen oder Explantation Kultur zu verwenden. In diesem System werden Ratten- oder Maus sind embryonalen Vorderhirns NSC kultiviert in einem definierten Medium ohne Serum und Enzyme. Die NSCs ausgedrückt Olig2 und Sox10, zwei Transkriptionsfaktoren in oligodendroc beobachtetyte Vorläuferzellen (OPC). Mit diesem System Wechselwirkungen zwischen FGF, BMP- und TGF- & bgr;-Signalgebung beteiligt ZEB1, Zeb2 und Twist2 wurden beobachtet , wo TGF & beta; Aktivierung signifikant die Zellmigration verbessert, was auf eine synergistische BMP- / TGFß-Interaktion. Die Ergebnisse weisen auf ein Netzwerk von FGF, BMP- und TGF- & bgr;-Signalgebung in EMT Einleitung und Aufrechterhaltung beteiligt. Dieses Modellsystem ist relevant EMT in vitro zu untersuchen. Es ist kostengünstig und weist eine hohe Reproduzierbarkeit auf. Es ermöglicht auch den Vergleich von verschiedenen Verbindungen bezüglich ihrer Migrationsantworten (quantitative Entfernungsmessung) und Hochdurchsatz-Screening von Verbindungen EMT (qualitative Messung) zu hemmen oder zu verstärken. Das Modell ist daher gut geeignet, Arzneimittel-Bibliotheken für Substanzen zu testen EMT zu beeinflussen.

Introduction

Während mehrere Stadien der embryonalen Entwicklung, verlieren Epithelzellen ihre starke Haftung zueinander (zB tight junctions) und erwerben einen Migrations Phänotyp in einem Prozess namens epitheliale zu mesenchymale Transition (EMT) 1. EMT ist für die Bildung von zusätzlichen Zelltypen, wie beispielsweise die mesenchymalen Neuralleistenzellen erforderlich, eine Population , die 2 aus dem Neuroepithel segregiert. EMT ist nicht nur wesentlich während Embryonalstadien , sondern auch in späteren Phasen des Erwachsenenlebens erforderlich physiologischen Prozesse im adulten Organismus zu halten, wie der Wundheilung 3 und des zentralen Nervensystems (ZNS) Regeneration in Läsionen 4 demyelinisierenden.

Epithelialen Tumoren sind bekannt für Migration, Invasion und Metastasierung von EMT als Initiations Schritt zu reaktivieren, was letztlich zu Krebs Progression führt 1,3. EMT in der Tat ist zentral zu starke Migration 1,3 verknüpft. Die zellulären Schritte conditioning, initiiert, unterziehen und EMT Aufrechterhaltung nicht vollständig verstanden werden und müssen weitere Untersuchungen.

Hier ist ein invitro – EMT Modellsystem auf Basis von NSCs, mit definierten Wachstumsfaktoren und Medien (kein Serum und keine Enzymeinsatz) wird vorgestellt. Dieses Modellsystem ist von Bedeutung für die Wissenschaftler auf EMT arbeiten. Die Schnecke, Zeb und Twist Proteinfamilien wurden für EMT sowohl in der Entwicklung und Krankheit 1 als kritisch gezeigt. Die Schnecke, Zeb und Twist Familien sind auch in dem vorgestellten System beteiligt. Das System basiert auf einem bestimmten Bereich des Vorderhirns, die normalerweise nicht EMT Bereitstellen während EMT Induktions für die Untersuchung der anfänglichen Ereignisse einen besonderen Vorteil erfährt.

Das Modellsystem könnte möglicherweise EMT in Epithelien angewendet werden außerhalb des ZNS zu studieren, da Schlüssel EMT-Induktoren wie die Schnecke, Zeb und Twist-Proteine, werden auch während der EMT in Gewebesystemen außerhalb des ZNS gefunden. Dieses Modell system ermöglicht die standardisierte Isolierung von NSCs aus der Entwicklung Cortex Stammzelleigenschaften im Allgemeinen und EMT insbesondere zu studieren. Mit diesem System isolierten wir NSCs, induzierte EMT und studierte die spätere Migration unter der Wirkung von FGF2 und BMP-4. Wir beobachteten, dass FGF und BMP-Signalgebung wirkt mit TGFß Signalzellmigration zu fördern, damit die Modellsystem zu validieren.

Protocol

Alle Tier Verfahren folgte dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" (NIH Veröffentlichung, 8. Auflage, 2011) und wurden von der Animal Welfare Committee von Basel (Schweizer Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren) zugelassen. Durch diese Leitlinien wird das Tier Protokoll des "niedrigsten Tierschweregrad" betrachtet. 1. Vorbereitung der Expansion Medium Hinweis: Arbeiten unter aseptischen Bedingungen als Standard für die Gewebekultur. </…

Representative Results

Dieses EMT Modellsystem auf die genormte Isolierung von NSC basierend sowohl als einzelne Zellen oder als Explantate aus einer bestimmten Region des Entwicklungs Neuralrohr, die zentrale cortex (1 und 2). Für die quantitative Beurteilung wurden Explantate direkt im Zentrum eines 500 & mgr; m Raster Kulturschale (Abbildung 3) ausgesät. Explantate von der zentralen Kortex wurden zunächst für zwei Tage ausgesetzt FGF2, durch zusätz…

Discussion

In dieser Studie wurde ein standardisiertes System für die EMT – Analyse unter Verwendung von NSCs beschrieben wird (im Ergänzungs Abbildung 3 zusammengefasst). Die Standardisierung gewährleistet Reproduzierbarkeit (Tabelle 1 und 2). Die NSCs werden von der Entwicklung Cortex abgeleitet, ein Gewebe, das normalerweise nicht EMT unterziehen. Dies ist von Vorteil für die Analyse der frühen Schritte in EMT. Erste Schritte in EMT nicht ausreichend in Tumorzellen untersucht werden, die g…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Studie wurde von der Universität Basel Science Foundation und der Schweizerischen National Science Foundation unterstützt durch einen Zuschuss zu MHS und AG (SNF IZLIZ3_157230) unterstützt. Wir danken: Dr. Tania Rinaldi Burkat für Infrastruktur großzügig bereitstellt; alle Mitglieder der Gruppe Bettler für Diskussionen und Kommentare. Wir danken Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Schweiz) für professionelle und kompetente Installation des Full-HD-MC170 Videokamera (Leica Microsystems, Schweiz).

Materials

BMP4, rhBMP4 RnD Systems  314-BP-01M
Bovine pancreas insulin Sigma  I1882
Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay Cell Biolabs CBA-110 24 well plate system
Cell culture dish with grid Ibidi 500 mm dish, 35 mm 80156
CellMask Orange Life Technologies C10045 Plasma membrane dye, use at 1:1000 .
DAPI LifeTechnologies D1306 Stock at 5mg/ml. Use at 1:10000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required.
DMEM/F12 1:1 medium bottle Gibco Invitrogen 21331-020
FGF2, rhFGF2 RnD Systems 233-FB-01M
Fibronectine, bovine Sigma  F4759
Glutamax supplement  Gibco Invitrogen  35050-061
Graphics software with pixel measurement feature Fiji fiji.sc/Fiji version 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS media Sigma  H9394
Human apo-Transferrin Sigma T1147 Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection.
L-glutamine Gibco Invitrogen  25030-024
Nestin, Mouse anti Nestin antibody Genetex GTX26142 Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody Provided by Hirohide Takebayash Personal stock Use at 1:2000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Penicillin/Streptomycin/Fungizone Gibco Invitrogen  15240-062
Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody Acris DM3614P Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100
Poly-L-ornithine Sigma  P3655
Putrescine Sigma  P5780 Skin and eye irritant. Appropriate protection required.
Sodium selenite Sigma  S5261
Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody Millipore Chemicon AB5774 Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
TGFb1, rhTGFb1 RnD Systems 240-B-010
Uncoated Petri dishes Falcon Corning 351029

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Sailer, M. H. M., Sarvepalli, D., Brégère, C., Fisch, U., Guentchev, M., Weller, M., Guzman, R., Bettler, B., Ghosh, A., Hutter, G. An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (114), e54018, doi:10.3791/54018 (2016).

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