Um Modelo de enzimas e Cultura de Células-Tronco Neural Serum-livre para EMT Investigation Adequado para Drug Discovery
Summary
Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.
Abstract
Epitelial para mesenquimal (EMT) descreve o processo de epitélio transdifferentiating em mesênquima. EMT é um processo fundamental durante o desenvolvimento embrionário que também ocorre frequentemente em glioblastoma, o tumor cerebral maligno mais frequente. EMT também tem sido observado em vários carcinomas fora do cérebro, incluindo o cancro da mama, cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro gástrico. EMT está centralmente ligada a malignidade por promoção da migração, invasão e formação de metástases. Os mecanismos de indução de EMT não são completamente compreendidos. Aqui, descrevemos um sistema in vitro para o isolamento padronizada de células estaminais neurais corticais (NCCC) e subsequente EMT-indução. Este sistema oferece a flexibilidade para usar tanto as células individuais ou cultura explante. Neste sistema, rato ou ratinho embrionárias NSC prosencéfalo são cultivadas num meio definido, isento de soro e enzimas. As NSC expressa Olig2 e SOX10, dois factores de transcrição observada em oligodendroccélulas precursoras yte (OPCs). Usando este sistema, as interacções entre FGF, BMP- e TGFp-sinalização envolvendo Zeb1, Zeb2, e Twist2 foram observados onde o TGFp-activação melhorado significativamente a migração de células, sugerindo um sinérgico / TGFp-interacção BMP-. Os resultados apontam para uma rede de FGF, BMP- e TGF-sinalização de estar envolvido na indução e manutenção EMT. Este sistema de modelo é relevante para investigar in vitro EMT. É rentável e mostra alta reprodutibilidade. Além disso, permite a comparação de diferentes compostos no que diz respeito às suas respostas de migração (medição quantitativa distância), e rastreio de alto rendimento de compostos que inibem ou aumentam EMT (medição qualitativa). O modelo é, portanto, bem adequado para testar bibliotecas de drogas para as substâncias que afectam a EMT.
Introduction
Durante vários estágios do desenvolvimento embrionário, células epiteliais perdem a sua forte aderência entre si (por exemplo, junções apertadas) e adquirir um fenótipo migratória em um processo chamado epitelial para mesenquimal (EMT) 1. EMT é necessário para a formação de tipos de células adicionais, tais como as células da crista neural mesenquimais, uma população que segrega do neuroepitélio 2. EMT não é apenas essencial durante a fase embrionária, mas também necessária em fases posteriores da vida adulta para manter os processos fisiológicos no organismo adulto, como a cicatrização de feridas 3 e sistema nervoso central de regeneração (CNS) em lesões desmielinizantes 4.
Tumores epiteliais são conhecidos para reativar EMT como uma etapa de iniciação para a migração, invasão e metástase, levando a progressão do câncer de 1,3. EMT está de facto ligado centralmente a uma forte 1,3 migração. Os passos de c celularesonditioning, iniciando, sofrendo e manutenção de EMT não são totalmente compreendidos e necessitam de uma investigação mais aprofundada.
Aqui, um padronizado sistema modelo in vitro baseado em EMT NSC, com factores de crescimento definidos e meios (sem soro e sem o uso de enzima) é apresentada. Este sistema modelo é de relevância para os cientistas que trabalham em EMT. O caracol, Zeb e torção famílias de proteínas têm sido mostrados para ser crítico para EMT tanto em desenvolvimento e uma doença. O caracol, Zeb e torção famílias também estão envolvidos no sistema apresentado. O sistema baseia-se numa região específica do cérebro anterior que, normalmente, não sofre EMT proporcionando uma vantagem particular para o estudo dos acontecimentos iniciais de indução durante EMT.
O sistema modelo poderia potencialmente ser aplicada ao estudo de EMT em epitélios fora do SNC, uma vez que os indutores EMT-chave, tais como o caracol, Zeb e proteínas torção, também são encontradas durante EMT em sistemas de tecido fora do SNC. Este modelo sistema permite o isolamento padronizado de NSCs a partir do córtex em desenvolvimento a estudar características de células-tronco em geral e EMT em particular. Usando este sistema, foram isoladas as NSC, EMT induzida e estudada a migração subsequente sob o efeito de FGF2 e BMP4. Observamos que FGF e interage BMP-sinalizando com TGF-sinalização para promover a migração celular, validando o sistema modelo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo um sistema padronizado para análise EMT NSCs utilizando é descrito (resumido na Suplementar Figura 3). A padronização garante a reprodutibilidade (Tabela 1 e 2). As NSC são derivadas do córtex em desenvolvimento, um tecido que normalmente não sofre EMT. Isto é de vantagem para a análise dos primeiros passos no EMT. passos iniciais na EMT não pode ser adequadamente estudado em células tumorais que se acumularam mudanças genéticas e pode já adoptadas caracterís…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O estudo foi apoiado pela Universidade de Basel Science Foundation ea National Science Foundation suíço por uma doação para MHS e AG (SNF IZLIZ3_157230). Agradecemos: Dr. Tania Rinaldi Burkat para generosamente fornecer infra-estrutura; todos os membros do grupo Bettler para discussões e comentários. Agradecemos Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Suíça) para a instalação profissional e competente da completa câmera de vídeo HD MC170 (Leica Microsystems, Suíça).
Materials
| BMP4, rhBMP4 | RnD Systems | 314-BP-01M | |
| Bovine pancreas insulin | Sigma | I1882 | |
| Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay | Cell Biolabs | CBA-110 | 24 well plate system |
| Cell culture dish with grid | Ibidi 500 mm dish, 35 mm | 80156 | |
| CellMask Orange | Life Technologies | C10045 | Plasma membrane dye, use at 1:1000 . |
| DAPI | LifeTechnologies | D1306 | Stock at 5mg/ml. Use at 1:10000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required. |
| DMEM/F12 1:1 medium bottle | Gibco Invitrogen | 21331-020 | |
| FGF2, rhFGF2 | RnD Systems | 233-FB-01M | |
| Fibronectine, bovine | Sigma | F4759 | |
| Glutamax supplement | Gibco Invitrogen | 35050-061 | |
| Graphics software with pixel measurement feature | Fiji | fiji.sc/Fiji | version 2.0.0-rc-30/1.49s |
| HBSS media | Sigma | H9394 | |
| Human apo-Transferrin | Sigma | T1147 | Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection. |
| L-glutamine | Gibco Invitrogen | 25030-024 | |
| Nestin, Mouse anti Nestin antibody | Genetex | GTX26142 | Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody | Provided by Hirohide Takebayash | Personal stock | Use at 1:2000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Penicillin/Streptomycin/Fungizone | Gibco Invitrogen | 15240-062 | |
| Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody | Acris | DM3614P | Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100 |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P3655 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Skin and eye irritant. Appropriate protection required. |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody | Millipore Chemicon | AB5774 | Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| TGFb1, rhTGFb1 | RnD Systems | 240-B-010 | |
| Uncoated Petri dishes | Falcon Corning | 351029 |
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