Isolieren von Haarfollikelstammzellen und epidermalen Keratinozyten von Dorsal Mäusehaut

Adulte Stammzellen (SCs) sind essentiell für die Aufrechterhaltung der Homöostase Gewebe durch sterbende Zellen zu ersetzen und beschädigten Gewebe auf Verletzungen zu reparieren. Diese SCs sind definiert durch ihre Fähigkeit , kontinuierliche Selbsterneuerung zu unterziehen und in verschiedene Zelllinien ^1-3 zu unterscheiden. Die am besten untersuchten Systeme, die bei Erwachsenen SCs für ihre Nachschub abhängig sind, gehören das hämatopoetische System, den Darm und die Haut ^1,2,4.

Während der Embryonalentwicklung, beginnt die Haut als eine einzelne Schicht von Epidermiszellen. Morphogenese des Haarfollikels (HF) beginnt , wenn mesenchymalen Zellen der Haut besiedeln und eine darunterliegende Dermis kollagenen ⁵ bilden. Specialized mesenchymalen Zellen, die später die Hautpapilla bilden (DP), organisieren direkt unter der Epidermis und stimulieren das Epithel Haar Plakoden zu bilden , die nach unten ⁶ zu wachsen beginnen. proliferierende hochMatrixZellen, am Boden des HF befindet,umhüllen diese mesenchymalen Zellen und bilden die Haarzwiebel, während die innere Schicht in konzentrische Zylinder zu unterscheiden beginnt den Haarschaft (HS) und dem umgebenden inneren Wurzelscheide (IRS) ^2,3 zu bilden.

In der postnatalen Leben ist die Haut Epidermis aus drei Kammern besteht: die interfollikulären Epidermis (IFE), der Talgdrüse (SG) und dem HF. Im Gegensatz zu der IFE und SG , die in einem ständigen Zustand der Homöostase sind, ist der HF ein dynamischer Mini-Organ , das kontinuierliche Zyklen von Wachstum (Anagen) erfährt, Zerstörung (catagen) und Ruhe (Telogen) ^4,7. Die Haarfollikel – Stammzellen (HFSCs) , dass der Kraftstoff dieser ewigen Kreislauf, befinden sich in einer Nische innerhalb der HF als Ausbuchtung bekannt ^4. Während Anagen die HFSCs die Beule zu verlassen, nach der Aktivierung Signale von der DP, beginnen wuchernden und absteigen nach unten so einen langen linearen Spur von Zellen als die äußere Wurzelscheide bekannt zu schaffen (ORS) ^8-10. Die Matrixzellen, dassumgeben das DP an der Basis des HF, schnell Zyklus und nach oben wandern terminalen Differenzierung erfährt somit die HS und der IRS – ¹⁰ (Abbildung 1) zu erzeugen. Die Dauer der Anagenphase bestimmt die Länge des Haares und ist abhängig von der proliferative und Differenzierungsfähigkeit der Matrixzellen ^6. Wenn die HF Catagen kommt, die Durchfuhr verstärkenden Matrixzellen in der Birne nicht mehr vermehren, Apoptose und vollständig zurückbilden , während die DP nach oben ziehen , bis sie die nicht- teil Teil des ^8,11 HF erreicht. Während dieses Zurückziehens bildet die HF eine temporäre Struktur wie der epithelialen Stranges bekannt, welche aus catagen charakteristisch ist, und enthält viele apoptotische Zellen. Bei Mäusen catagen dauert zwischen 3-4 Tagen und wird in der ersten Haarzyklus hoch synchronisiert. Wenn die HF Telogen alle HFSCs erreicht werden Ruhe. Die unterschiedlichen Stufen des HF-Zyklus werden auch durch Veränderungen in der Farbe der Maushaut durch m gekennzeichnetelanin Produktion. Die Haut von schwarz während Anagen bis dunkelgrau während catagen während Telogen ^6,7,12,13 bis rosa.

Abbildung 1: Haarfollikels Zyklus. Die HF besteht aus einem permanenten oberen Teil und einem unteren ständig Umbau, Radfahren Abschnitt, der kontinuierlichen Zyklen des schnellen Wachstums (Anagen) erfährt, Zerstörung (catagen) und einer relativen Ruhe Phase oder Ruhe (Telogen). Bitte klicken Sie hier ein , um zu vergrößern Version dieser Figur.

Die SCs die HF Aufrechterhaltung wurden zunächst mit Chase – Experimenten identifiziert, mit tritiiertem Thymidin, die eine Bevölkerung von langsamen Radfahren Etiketthaltezellen (LRC) ergab , dass ¹⁴ knapp unterhalb der SG in der permanenten Bereich der HF wohnhaft war . Die Fortschritte in der HFSCCharakterisierung ergab eine kleine Anzahl von Markern, die verwendet werden können , spezifische SCs von der HF Nische ¹⁵ zu identifizieren und zu isolieren. Vielleicht ist der beste Marker für die Anreicherung von HFSCs ist CD34, ein Zelloberflächenmarker auch als hämatopoetische SC Marker identifiziert beim Menschen ^16. Innerhalb dieser CD34 ⁺ Populationen zwei unterschiedliche Populationen wurden auf α6 Integrinexpression ² auch isoliert basiert. Ein weiterer Marker ist Keratin 15 (K15) , die stark in der bauchige Bereich ausgedrückt wird, co-lokalisiert mit CD34 – Expression und eine K15 – Promotor für das Targeting und die Isolierung HFSCs in transgenen Tieren ^15,17-19 verwendet. In den letzten zehn Jahren haben mehrere andere unterschiedliche Populationen von HFSCs und Vorläuferzellen auch im HF wohnen ^17,20-27 berichtet.

Eine weitere spannende Feature von HFSCs ist ihr Beitrag zur Haut zu reparieren. Unter normalen Bedingungen wieder aufzufüllen HFSCs die HF und nehmen nicht an IFE Homöostase. However, als Reaktion auf Verwundung, verlassen diese Zellen ihre SC Nische und die Hilfe bei der IFE ⁹ repopulating. Wir haben kürzlich gezeigt , dass Mäuse , die pro-apoptotische SEPT4 / ARTS Gen Anzeige eine erhöhte Anzahl von CD34, K15 und Sox9 ⁺ HFSCs, gelöscht , die eine Resistenz gegenüber Apoptose zeigen. HFSCs wurden aus SEPT4 / ARTS isoliert ^{– / –} dorsale Haut fluorescence activated cell Verwendung Sortierung (FACS) , und es war mehr als eine zweifache Zunahme in der Anzahl von CD34 ⁺ und K15 ⁺ HFSCs. Diese SEPT4 / ARTS ^{– / –} HFSCs wurden in vitro erweitert und nicht nur gab Anlass zu mehr Kolonien , sondern konnten auch härteren Bedingungen standhalten , im Vergleich zu den Kontrollen ^28.

Als Folge einer erhöhten Anzahl von HFSCs aufweist, SEPT4 / ARTS ^{– / –} -Mäusen signifikant schneller als Reaktion auf Hautexzision Verletzungen geheilt. Auffallender, SEPT4 / ARTS ^{– / –} Mäuse displayeda große Anzahl von regenerierten HFs aus dem Wundbett und deutlich kleinere Narben. Weiterhin für XIAP (X-chromosomal – Inhibitor der Apoptose) gelöscht Mäuse, die biochemische Ziel von ARTS, zeigte beeinträchtigte Heilung ^28.

Unsere Ergebnisse und die Arbeit in anderen Laboratorien haben gezeigt, dass HFSCs als ideales Modell für die Biologie und Funktion von Erwachsenen SCs zu studieren. Hier beschreiben wir die Methodik für die Anreicherung und Isolierung von HFSCs und epidermalen Keratinozyten auf der Grundlage der Expression von vier Marker: Integrin α6; Integrin β1; Sca-1 (ein Marker für den epidermalen Keratinozyten) und CD34. Ähnliche Isolierung von K15 ⁺ HFSCs können auch die K15-GFP reporter Maus ¹⁹ durchgeführt werden.