Isoleren haarfollikel stamcellen en epidermale keratinocyten van Dorsale Mouse Skin

Volwassen stamcellen (SC's) zijn essentieel voor het behoud van weefselhomeostase vervangen stervende cellen en beschadigd weefsel te herstellen na letsel. Deze SC's worden gedefinieerd door hun vermogen om voortdurende zelfvernieuwing te ondergaan en te differentiëren in verschillende cellijnen ^1-3. De best bestudeerde systemen, die afhankelijk zijn van volwassenen SC's voor hun replenishment zijn, zijn onder andere het hematopoietische systeem, de darm en de huid ^1,2,4.

Tijdens embryogenese, de huid begint als een enkele laag van epidermale cellen. Morfogenese van de haarfollikel (HF) start wanneer mesenchymale cellen bevolken de huid en vormen een onderliggende dermis collagene ^5. Gespecialiseerd mesenchymale cellen, die later de dermal papilla (DP) vormen, rechtstreeks te organiseren onder de epidermale laag en het stimuleren van het epitheel om haar placodes die beginnen naar beneden ⁶ groeien vormen. Sterk prolifererende cellen matrix, gelegen aan de voet van de HF,envelop deze mesenchymale cellen en vormen de haarwortel, terwijl de binnenlaag begint te differentiëren in concentrische cilinders de haarschacht (HS) en de omringende binnenste schede (IRS) ^2,3 vormen.

In het postnatale leven huidepidermis bestaat uit drie compartimenten: de interfolliculaire epidermis (IFE), de talgklier (SG) en HF. In tegenstelling tot de IFE en SG, die in een constante staat van homeostase, de HF is een dynamische mini-orgaan dat continue cycli van groei (anagen), vernieling (catagen) en rust (telogen) ^4,7 ondergaat. De haarfollikel stamcellen (HFSCs) die brandstof dit eeuwige cyclus, wonen in een niche binnen de HF die bekend staat als de bobbel ^4. Tijdens Anagen de HFSCs verlaat de bobbel, na activering signalen van de DP, beginnen uitdijende en daal af naar beneden waardoor een lange lineaire spoor van cellen bekend als de buitenste wortel schede (ORS) ^8-10. De matrix cellen, datomringen de DP aan de basis van het HF, snelle cyclus migreren opwaartse differentiatie ondergaan waardoor de HS en de IRS ¹⁰ (figuur 1) genereren. De duur van anagen bepaalt de lengte van het haar en is afhankelijk van de proliferatie en differentiatie capaciteit van de matrix ⁶ cellen. Wanneer de HF binnengaat catagene, de transit versterken matrix cellen in de bol niet langer te laten groeien, te ondergaan apoptose en regressie geheel, terwijl het trekken van de DP omhoog totdat deze de niet-cycling deel van het HF ^8,11 bereikt. Tijdens dit terugtrekken HF vormt een tijdelijke structuur zogenaamde epitheliale streng, die kenmerkend catagene en bevat vele apoptotische cellen. Bij muizen catagen duurt tussen 3-4 dagen en is sterk gesynchroniseerd in de eerste haarcyclus. Wanneer de HF telogen reikt HFSCs geworden rustig. De verschillende fasen van de HF-cyclus worden ook gekenmerkt door veranderingen in de kleur van de huid van de muis vanwege melanin productie. De huid verandert van zwart tijdens anagen tot donkergrijs tijdens catagen naar roze tijdens telogene ^6,7,12,13.

Figuur 1: de haarfollikel Cycle. De HF is samengesteld uit een vast bovenste deel en een onderste voortdurend verbouwen, fietsen gedeelte dat continue cycli van snelle groei (anagen), vernieling (catagen) en een relatieve rust fase of rust (telogene) ondergaat. Klik hier voor een grotere weergave versie van deze figuur.

De SC behoud van de HF werden aanvankelijk geïdentificeerd met behulp van chase experimenten met getritieerd thymidine, dat een bevolking van trage fietsen label behoud van cellen (LRC), die woonde in de permanente regio van de HF net onder de SG ¹⁴ geopenbaard. Vooruitgang in HFSCkarakterisatie onthulde een klein aantal markers die kunnen worden gebruikt om specifieke SC identificeren en isoleren van de HF niche ^15. Misschien is de beste marker voor de verrijking van HFSCs is CD34, een celoppervlak marker ook geïdentificeerd als een hematopoietische SC marker bij de mens ^16. Binnen deze CD34 ⁺ populaties twee verschillende populaties ook geïsoleerd gebaseerd op α6 integrine expressie ^2. Een andere marker is keratine 15 (K15) die sterk tot expressie gebracht in het bultgebied, co-lokaliseert met CD34 expressie en K15 promoter wordt gebruikt voor het richten en het isoleren HFSCs in transgene dieren ^15,17-19. In de afgelopen tien jaar een aantal andere verschillende populaties van HFSCs en voorlopercellen zijn ook gemeld in het HF ^17,20-27 te verblijven.

Een extra interessante functie van HFSCs is hun bijdrage aan de huid te herstellen. Onder normale omstandigheden HFSCs vervult de HF en geen deel aan IFE homeostase niet nemen. However, in reactie op verwonding, deze cellen sluiten de SC niche en steun herbevolken IFE ^9. We hebben onlangs aangetoond dat muizen verwijderd voor de pro-apoptotische Sept4 / kunst gen weergave een verhoogd aantal CD34, K15 en SOX9 ⁺ HFSCs, die een resistentie tegen apoptose te tonen. HFSCs werden geïsoleerd uit Sept4 / kunst ^{– / –} dorsale huid gebruikmaking fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) en er was meer dan een tweevoudige toename van het aantal CD34 ⁺ en K15 ⁺ HFSCs. Deze Sept4 / kunst ^{– / –} HFSCs werden geëxpandeerd in vitro en niet alleen gaf aanleiding tot meer kolonies maar konden ook zwaardere omstandigheden te weerstaan ​​in vergelijking met controles ^28.

Door met een verhoogd aantal HFSCs, Sept4 / kunst ^{– / –} muizen aanzienlijk sneller genezen als reactie op huidexcisie verwondingen. Opvallend Sept4 / ARTS ^{– / –} muizen displayeda groot aantal geregenereerd HFs uit de wond bed, en aanzienlijk kleinere littekens. Bovendien, muizen verwijderd XIAP (X-gebonden inhibitor van apoptose), de biochemische doelwit van KUNSTEN, toonde gestoorde genezing ^28.

Onze resultaten en de werkzaamheden in andere laboratoria hebben aangetoond dat HFSCs dienen als een ideaal model voor het bestuderen van de biologie en de functie van de volwassen SC. Hier beschrijven we de methode voor de verrijking en isolatie van HFSCs en epidermale keratinocyten basis van de expressie van vier markers: α6 integrine; integrine β1; Sca-1 (een marker voor epidermale keratinocyten) en CD34. Vergelijkbare isolatie van K15 ⁺ HFSCs kan ook worden uitgevoerd met behulp van de K15-GFP reporter muis ^19.